진드기의 RNA 간섭

1. dsRNA의 생성. dsRNA의 시험 관내 전사 및 합성 (예를 들어, Dermacentor에 대한 oligonucleotide primers subolesin에게 D8AAT75를 사용 variabilis에 대한 T7 프로 모터 시퀀스를 포함하는 oligonucleotide primers를 합성 : 5' – TAATACGACTCACTATAGGGTACTGACTGGGATCCCCTGCACAGT – 3 '와 D8DVT73 : 5' – TAATACGACTCACTATAGGGTACTCGAGCTTGGTGGAAAGGACG – 3'). RT – PCR은 각 oligonucleotide 뇌관과 틱 총 RNA 중 1-10 NG 10 pmol를 사용하여 대상 유전자를 증폭. PCR 제품을 정화. 정화 PCR 제품의 8 μL를 사용하여 dsRNA를 합성. 분석법에 의해 dsRNA를 계량. 2. dsRNA와 진드기의 사출. 2.1. 주사 진드기의 준비. 첫째, 50 ML 일회용 원심 분리기 튜브의 각 솔루션에서 그들을 흔들어 진드기를 유지하기 위해 튜브 톱을 통해 고급 메쉬 와이어 화면을 통해 솔루션을 decanting하여 솔루션의 일련의 진드기 씻으십시오. 세탁 진드기에 대한 솔루션의 순서는 수돗물, 3 % 과산화수소, 증류수, 70 % 에탄올과 증류수로 두 번 더 씻는다 두 씻는다입니다. 종이 타올에있는 진드기를 얼룩 건조. 실험에 따라, 20 50 그룹으로 진드기를 계산, 실험 그룹의 번호로 단단히 장착되어 뚜껑과 라벨을 가진 1.25 온스 플라스틱 컵의 각 그룹에서 진드기를 놓습니다. 2.2. 사출 팀 틱. RNAi 팀은 세 사람으로 구성되어 있습니다 : (1) 붉은 치과 왁스의 시트에 부착된 이중 끈적끈적한 테이프의 각 체크를 위치 한 사람이, 후에 진드기를 모니터링 진드기 (3) 한 사람을 주사 (2) 한 사람 사출 그들을 활성화하는 진드기에 CO 2를 통기하여 실험 그룹의 번호로 표시 컵에 사는 진드기로 계산됩니다. 모든 팀 구성원은 일회용 장갑을 착용해야합니다. 2.3. 주사 진드기의 배치. 더몬트 미세 집게를 사용하여 체크를 캡처하여 붉은 치과 왁스의 3 "X 6"시트에 부착된 스티커를 두 번 테이프에 복부 쪽을 놓으십시오. 진드기는 밀접한 5 진드기의 그룹에서 함께 위치하고 있습니다. 모든 5 진드기의 mouthparts 더들을 구속하기 위해 이상의 마스킹 테이프의 작은 스트립을 플레이스하지만 사출 과정이 체크 주입기 (그림 1)에 의해 관찰 수 있도록 노출 신체의 대부분을 떠나있는 동안. 2.4. 진드기의 사출. 진드기는 외골격의 복부 표면의 오른쪽 하단 사분면에 주입됩니다. 첫째, 피어스 ½ ", 29 게이지 바늘 (그림 2A)가 장착되어 Monoject의 인슐린 주사기를 사용하여 외골격에 구멍. 45 ° beveled 포인트와 1 인치 33 게이지 바늘로 맞춤 제작 해밀턴 주사기를 사용하여 – (μL 당 5 X 10 11 분자 5 × 10 10) (그림 2B) dsRNA 솔루션의 0.2-0.5 μL 즉시 개나 주사 . 바늘은 dsRNA의 배치 및 유지를 확보하기 위해 틱 캐비티에 잘 배치해야합니다. 어떤 액체가 주입 사이트 (그림 2C)에서 탈출 가능성이 높습니다. 관리는 이상 hemolymph의 손실을 일으킬 것입니다 진드기를 주입하고 진드기의 죽음을 일으킬 수하지 않도록해야합니다. 각 실험 그룹의 주사를 완료한 후 해밀턴 주사기를 청소합니다. 또 다른 실험 그룹에 대한 사용하기 전에. 폐기물 컨테이너에 추방, 15 번 반복 후 3 % 과산화수소를 포함하는 비커에서 먼저 주사기를 작성합니다. 폐기물 컨테이너에 추방, 15 번 반복 후 멸균 물을 들어있는 비커에서 주사기를 작성합니다. 벤트 경우, 플런저가 원활하게 이동하고 진드기의 주입에 필요한 부드러운 터치에 응답하지 않습니다, 때문에 해밀턴 주사기의 플런저를 구부 않도록주의를 가져가라. 2.5. 주사 후 진드기의 치료. 좋은 포셉 즉시 더블 끈적끈적한 테이프에서 주입 체크를 들고 플라스틱 복구 컨테이너 (약 6 "X 6"과 진드기의 탈출을 방지하기 위해 마스킹 테이프와 함께 반지를 낀)에 놓으십시오. 진드기는 주사 후 간략하게 운영 중지 상태가됩니다하지만 곧 접시 주위에 크롤 링을 시작합니다. 입김을 즉시 진드기를 활성화에 도움이되는 복구 컨테이너에서 그들을 배치 후 진드기에 2 CO. 진드기가 크롤 링하고 활성화되면, 사출 상처가 빠르게 치유하고 그들이 가장 가능성이 살아남을 것입니다. 각 실험 그룹의 숫자에 따라 진드기를 카운트하고 단단하게 장착되어 뚜껑이있는 표시 플라스틱 컵에서 그들을 놓으십시오. 대체 진드기는 언제는 다음 실험 그룹을 주입하기 전에 죽었를 대체하는 주입해야합니다. 2.6. 개최 틱. 습도 챔버에있는 진드기 (12hr 밝은 장소 : 22-25 12 시간 어두운 photoperiod을 ° C 및 95 %의 상대 Humidity) 및 1 일 개최. 틱 수유 세포에 넣어 거려, 실험 그룹 당 하나는 양에 접착시키고 uninjected 남성 또는 여성 진드기 (주입 아니었 중에서 성별)의 동일한 번호와 피드 수 있습니다. 충만 피드 여성 진드기는 10 먹이의 일 때 제어 여성 후 양에서 제거됩니다 이들은 호스트 수집 무게 아르를 떨어뜨리고있다. 종이팩에 진드기를 삽입하고, 산란의 완성까지 습도 챔버하다. 가중치 그룹의 모든 진드기에 의해 생산되는 계란 질량에 의해 산란을 평가해보십시오. 2.7. RNAi 후 틱 표현형 분석. , 틱 중량, 산란 및 달걀 다산 살아남은 진드기의 수를 결정하여 수유 후 표현형 틱 평가. 그러나, 다른 분석은 연구의 대상 유전자와 목적에 따라 수행할 수 있습니다. 3. RT – PCR로 유전자 입을를 확인 분석. 수유 후 제어 주입 및 dsRNA – 주입 그룹에서 개별 진드기의 침샘과 배짱을 해부하다. 개별 조직 샘플에서 총 RNA를 추출합니다. 실시간 RT – PCR에 의해 개별 조직의 목표 유전자 성적표를 분석하고 틱 16에 대한 RNA 수준을 정상화는 genNorm 방법 (생물 래드 iQ5 일반용, 버전 2.0에 의해 구현으로 ddCT 방법)을 사용하여 rRNA. 한 amplicon이 형성되도록하는 반응의 끝에 그 해리 곡선을 실행하여 모든 시료에 대해 동일한 온도 범위에서 일관되게 amplicons의 변성. mRNA 수준 (표준 CT 값) 제어 주입 및 dsRNA – 주입 진드기는 학생`S T 테스트 (P는 = 0.05)를 사용하여 사이를 비교합니다. 4. 대표 결과 : 프로토콜은 여기에 (표 1) 다양한 ixodid 틱 수종에 RNAi을 위해 저희 실험실에서 사용되었습니다 설명했다. 진드기에 주입 dsRNA의 금액은 체크의 크기에 따라 다릅니다; 큰 틱 종 더 큰 볼륨을 수용할 수 있습니다. 부정적인 제어 진드기는 관련이없는 dsRNA로 주입해야합니다. 이러한 subolesin 14-19,22-25,27-32,34 및 베타 굴지 20,21 등 여러 dsRNAs는 긍정적인 컨트롤로 사용할 수 있습니다. 그것이 혼합 dsRNA 솔루션을 피하기 위해 트리 트먼트를 사이에 주사기를 씻어하는 것이 중요합니다. 프로토콜이 제대로되면 5 % 미만의 사망률은 24 시간 후 주사 절차에서 얻을 수 있습니다. 진드기의 유전자 최저 후 전형적인 표현형 보호하는 항원을 체크를 위해 화면을 위해 dsRNA의 수영장과 함께 주입 진드기의 패널​​로 그림 3에 표시됩니다. 종 틱 dsRNA는 주입 참조 Ixodes scapularis의 cDNA 도서관, subolesin, 굴지, nucleotidase, NF – KB, akirin 21, 22, 29, 30 Dermacentor variabilis subolesin, GST, ubiquitin, vATPase, selenoproteins M과 W2a, 조혈 줄기 / 전구 세포 굴지 Proteasome 26S subunit, ferritin1, varisin, akirin, 단백질과 같은 15, 19, 22, 24, 26, 30-32 Dermacentor marginatus subolesin 22 Amblyomma americanum cDNA 도서관, subolesin, akirin 17, 22, 30 Amblyomma hebraeum subolesin, voraxin 28 Rhipicephalus의 sanguineus Rs86, subolesin 22, 23 Rhipicephalus microplus GST, ubiquitin, selenoprotein, Bm86, Bm91, subolesin, GI, GIII, EF1a, flagelliform 실크 단백질, 폰 Willebrand 인자 16, 18, 25, 27 Rhipicephalus의 annulatus ubiquitin, subolesin, EF1a, GIII 16 표 1. RNAi 프로토콜이 사용되었습니다있는 수종으로 톡톡 두드려. 그림 1. 빨간 치과 왁스의 시트을 준수 더블 스티커 테이프에 진드기의 배치, 최대 복부 측면. 진드기는 마스킹 테이프의 작은 스트립이 주입기는 주입 중에 진드기의 사체를 관찰 수 있도록하면서 추가로 진드기를 확보하기 위해 mouthparts 위에 배치되는 후, 5 그룹에 배치됩니다. 그림 2. 분사 절차는 인슐린 싸이로 틱 외골격의 (A) 오른쪽 아래 사분면 피어싱을 포함ringe는 주사 사이트를 만들기 위해 29 게이지 바늘로 장착되어, (C) 대부분은 / 틱 hemolymph의 일부 누수가 발생합니다 33 게이지 바늘로 해밀턴 주사기를 사용하여이 사이트에서 dsRNA의 (B) 즉시 분사 유체. 그림 3. RNAi가 Amblyomma americanum에서 진드기 항원에 대한 보호 화면으로 사용된있는 체크 여섯 그룹의 패널. 긍정적인 subolesin RNAi 제어 및 부정 무관한 dsRNA 제어와 비교하면 진드기의 phenotypic 변화를 볼 수 있습니다. 본 실험에서는 각 그룹의 틱 사망률, 무게, 그리고 산란에 대한 RNAi의 효과는 통계적으로 분석했다.