Endojen Wild-tip BRCA1 Express hücreler kullanarak Homolog Rekombinasyon BRCA1 Mutasyonlar Etkileri belirlenmesi
Summary
Biz RNAi kullanarak bir hücrenin endojen BRCA1 protein tüketen ve bir kodlama değişiklik içeren bir BRCA1 noktası mutant yerine homolog rekombinasyon DNA hasarı tamir için bir doku kültürü bazlı analiz BRCA1 varyantları test etmek için bir yöntem sağlar.
Abstract
Missense mutasyon, fonksiyonel analiz endojen protein hücre varlığı ile karmaşık olabilir. BRCA1 yapı-işlev analizleri, tam uzunlukta BRCA1 protein ve hypomorphic BRCA1 protein 1,2,3,4,5 ifade hücre hatları ile çalışan doğasında zorluklar için sağlam bir tahlil eksikliği ile komplike olmuştur . Biz bir hücreye endojen BRCA1 protein akut BRCA1 mRNA 3'-UTR hedefleyen RNAi tükenmiş ve bir plazmid BRCA1 varyant ifade co-transfecting yerini sayede bir sistem geliştirdi. Bu prosedürün bir avantajı BRCA1 ve eş zamanlı yedek akut susturulması hücreleri BRCA1 fonksiyon kaybı telafi etmek için zaman içinde ortaya çıkabilecek ikincil mutasyonlar veya uyarlamalar olmadan büyümeye izin veren. Bu tükenmesi ve add-back işlemi kolayca homolog rekombinasyon aktivite için test HeLa kaynaklı hücre hattı yapıldı. Homolog rekombinasyon tahlil rekombinasyon substrat genom (Şekil 1) 6,7,8,9 entegre sayede daha önce yayınlanmış bir yöntem dayanmaktadır . Bu rekombinasyon substrat etkin olmayan bir GFP allel içinde nadir kesim I-SCEI restriksiyon enzimi sitesi ve aşağı ikinci bir inaktif GFP allel. Homolog rekombinasyon tarafından tamir edilebilir çift iplikli bir ara, I-SCEI sonuçları ifade ve homolog rekombinasyon ara tamir eğer kolayca GFP protein ekspresyonu için flow sitometri tarafından atılırsa aktif bir GFP allel oluşturur plazmid, Transfeksiyon . Endojen BRCA1 tükenmesi homolog rekombinasyon aktivite 8-10 kat azalma ve vahşi-tip plazmid tam homolog rekombinasyon fonksiyonu restore add-back. Belirli bir noktaya tam uzunlukta BRCA1 mutantlar co-transfekte plazmid ifade edildi, özel missense mutant etkisi atılır. Bir örnek olarak, BRCA1 (M18T) protein, bilinmeyen bir klinik önemi 10 varyant, ifade, bu hücrelerin de ifade edildi, homolog rekombinasyon BRCA1-bağımlı geri yüklemek için başarısız oldu . Bilinmeyen bir önemi de başka bir versiyonudur kontrast, ifade, BRCA1 (I21V) tam BRCA1 bağımlı homolog rekombinasyon fonksiyonu restore. BRCA1 missense mutasyon fonksiyon testleri Bu strateji centrosome fonksiyonu (Kais ve ark, yayınlanmamış gözlemler) assaying başka bir biyolojik sistemi tatbik edilmiştir. Genel olarak, bu yaklaşım, resesif analiz edilmelidir herhangi bir gen missense mutantların analizi için uygundur.
Protocol
Discussion
Bu yöntemin avantajı, yabani tip endojen ifade BRCA1 hücreleri kullanılarak homolog rekombinasyon DNA onarımı düzenleyen BRCA1 protein fonksiyonu çalışma. Biz iki ayrı kurulmuş yöntemleri homolog rekombinasyon sürecinin eğitim ve DNA tamir fonksiyonu için BRCA1 varyantları test etmek için yeni bir yöntem elde etmek için RNAi-aracılı tükenmesi kullanan kabul ettiler. Bu yöntemin başarısı için anahtar GFP dönüşüm çok yüksek düzeyde elde böyle genom rekombinasyon substrat gibi HeLa gibi kolay transfectable bir hücre hattı kurmak oldu. Saptanabilir arka plan GFP sinyali elde etmek için birden fazla klonlar orijinal dönüşüm elenmiş, ama plazmid I-SCEI ifade transfeksiyon üzerine GFP dönüşüm çok yüksek bir düzeyi vardı.
Bu yöntem ile, şimdi homolog rekombinasyon fonksiyonu için diğer özel BRCA1 amino asit kalıntıları araştırıyoruz. Bu çalışma, biyolojik anlayışlar ile birlikte, bu sonuçlara klinik kanser genetiği uygulanabilir. BRCA1 missense mutasyon yüzdesi yüksek, çok nadir varyantları vardır beri bilinmeyen klinik önemi vardır ve bu çok genetik segregasyon analizi 3,10,13,14 kanseri ilişkiyi belirlemek için yeterli bilgi yoktur . Bu yöntemi kullanarak, BRCA1 homolog rekombinasyon düzenleyen biyolojik işlevi belirli bir varyant sonuçlarını kendi genomunda bu varyantlarının bir taşıyan kadınları bilgilendirmek için kullanılabilir.
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz bu iş için fon sağlamak için Ohio State Üniversitesi Kapsamlı Kanser Merkezi'nde minnettarız.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| DMEM | Invitrogen | 11960 | ||
| FBS | USA Scientific | 9871-5200 | ||
| siRNA | Invitrogen | N/A | ||
| Lipofectamine-2000 | Invitrogen | 11668 | ||
| TrypLE | Invitrogen | 12604 | ||
| Puromycin | Enzo Life Sciences | BML-GR312 | ||
| Opti-MEM I | Invitrogen | 31985 | ||
| Sodium Pyruvate | Invitrogen | 11360 | ||
| GlutaMAX I | Invitrogen | 35050 | ||
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140 |
Referencias
- Carvalho, M. A. Determination of cancer risk associated with germ line BRCA1 missense variants by functional analysis. Cancer Res. 67, 1494-1501 (2007).
- Couch, F. J. Genetic epidemiology of BRCA1. Cancer Biol Ther. 3, 509-514 (2004).
- Couch, F. J. Assessment of functional effects of unclassified genetic variants. Hum Mutat. 29, 1314-1326 (2008).
- Tomlinson, G. E. Characterization of a breast cancer cell line derived from a germ-line BRCA1 mutation carrier. Cancer Res. 58, 3237-3242 (1998).
- Ruffner, H., Joazeiro, C. A., Hemmati, D., Hunter, T., Verma, I. M. Cancer-predisposing mutations within the RING domain of BRCA1: loss of ubiquitin protein ligase activity and protection from radiation hypersensitivity. Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 5134-5139 (2001).
- Moynahan, M. E., Chiu, J. W., Koller, B. H., Jasin, M. Brca1 controls homology-directed DNA repair. Mol Cell. 4, 511-518 (1999).
- Nakanishi, K. Human Fanconi anemia monoubiquitination pathway promotes homologous DNA repair. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 1110-1115 (2005).
- Pierce, A. J. Double-strand breaks and tumorigenesis. Trends Cell Biol. 11, 52-59 (2001).
- Ransburgh, D. J., Chiba, N., Ishioka, C., Toland, A. E., Parvin, J. D. Identification of breast tumor mutations in BRCA1 that abolish its function in homologous DNA recombination. Cancer Res. 70, 988-995 (2010).
- Easton, D. F. A systematic genetic assessment of 1,433 sequence variants of unknown clinical significance in the BRCA1 and BRCA2 breast cancer-predisposition genes. Am J Hum Genet. 81, 873-883 (2007).
- Snouwaert, J. N. BRCA1 deficient embryonic stem cells display a decreased homologous recombination frequency and an increased frequency of non-homologous recombination that is corrected by expression of a brca1 transgene. Oncogene. 18, 7900-7907 (1999).
- Pierce, A. J., Hu, P., Han, M., Ellis, N., Jasin, M. Ku DNA end-binding protein modulates homologous repair of double-strand breaks in mammalian cells. Genes Dev. 15, 3237-3242 (2001).
- Spearman, A. D. Clinically applicable models to characterize BRCA1 and BRCA2 variants of uncertain significance. J Clin Oncol. 26, 5393-5400 (2008).
- Sweet, K., Senter, L., Pilarski, R., Wei, L., Toland, A. E. Characterization of BRCA1 ring finger variants of uncertain significance. Breast Cancer Res Treat. 119, 737-743 (2009).
