Organotypic hippocampus Slice kulturer
Summary
Vi beskriver en metod för att förbereda organotypic hippocampus skivor som lätt kan anpassas till andra delar av hjärnan. Hjärnan skivor läggs på porösa membran och mediekulturen tillåts bilda ett gränssnitt. Denna metod bevarar de grova arkitektur hippocampus i upp till 2 veckor i kulturen.
Abstract
Hippocampus, en del av det limbiska systemet spelar en viktig roll i långtidsminnet och rumslig navigering 1. Hippocampus nervceller kan ändra styrkan i deras anslutningar efter korta perioder av stark aktivering. Detta fenomen, som kallas långsiktig potentiering (LTP) kan pågå i timmar eller dagar och har blivit den bästa kandidaten mekanism för inlärning och minne 2. Dessutom har väl definierade anatomi och anslutning av hippocampus 3 gjorde det till en klassisk modell för att studera synaptisk transmission och synaptisk plasticitet 4.
Som vår förståelse av fysiologi hippocampus synapser växte och molekylära spelare blev identifierade, blev ett behov av att manipulera synaptiska proteiner absolut nödvändigt. Organotypic hippocampus kulturer ger möjlighet för enkel genmanipulation och exakt farmakologisk intervention men behålla synaptiska organisation som är avgörande för att förstå synaps fungerar i ett mer naturalistiskt sammanhang än dissocierade rutin kultur nervceller metoder.
Här presenterar vi en metod för att förbereda och kultur hippocampus skivor som lätt kan anpassas till andra delar av hjärnan. Denna metod ger enkel åtkomst till skivor för genetisk manipulation med hjälp av olika metoder såsom virusinfektion 5,6 eller biolistics 7. Dessutom kan skivor lätt återvinnas för biokemiska analyser 8, eller överföras till mikroskop för avbildning 9 eller elektrofysiologiska experiment 10.
Protocol
Discussion
Denna metod är baserad på den metod som först beskrevs av Stoppini et al. Och 11 erbjuder ett snabbt sätt till kultur hippocampus skivor. Den viktigaste aspekten av detta protokoll är att upprätthålla skivor steril, därför är det viktigt att använda lämpliga sterila tekniker och att korrekt desinficera och sterilisera allt material i kontakt med vävnad.
Olika serum källor kan påverka kvaliteten på skivorna. Vi rekommenderar att du provar flera partier för…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete har finansierats av NINDS – NIH R01NS060756
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Cell culture inserts | Millipore | PICM03050 | ||
| 6 well plates | BD Falcon | 353046 | ||
| Tissue Slicer | Stoelting | 51425/51415 | ||
| Microscope | Olympus | SZX7-ILLD2-100 | ||
| Hippocampus dissecting tool | F.S.T | 10099-15 | ||
| Large utility scissors. Perfection | F.S.T | 37500-00/37000-00 Right/ Left handed | ||
| Iris Spatula | F.S.T | 10093-13 | ||
| Straight spatula | F.S.T | 10094-13 | ||
| Rounded spoon micro spatula | VWR | 57949-039 | ||
| Dissecting single cutting edge needle | Electron Microscopy Science | 72946 | ||
| Dissecting tweezers | Dummont | #2 | ||
| Small dissecting scissors | F.S.T | 14060-10 | ||
| MEM Eagle medium | Cellgro | 50-019 PB | ||
| Horse serum heat inactivated | Invitrogen | 26050-88 | ||
| L-Glutamine (200 mM) | Invitrogen | 25030081 | ||
| CaCl2 (1 M) | Sigma | C3881 | ||
| MgSO4 (1 M) | Sigma | M2773 | ||
| Insulin (1 mg/ml), dissolved in HCl 0.01 N | Sigma | I0516 | ||
| Ascorbic Acid, solution (25%) | Sigma | A4544 | ||
| D-Glucose | Sigma | G5767 | ||
| NaHCO3 | Sigma | S6014 | ||
| Hepes | Sigma | H7523 | ||
| Sucrose | Sigma | S5016 | ||
| Phenol Red Solution 0.5% in DPBS | Sigma | P0290 | ||
| KCl | Sigma | P3911 | ||
| MgCl2 (1 M) | Sigma | M9272 |
Referencias
- Martin, S. J., Grimwood, P. D., Morris, R. G. Synaptic plasticity and memory: an evaluation of the hypothesis. Annu Rev Neurosci. 23, 649-711 (2000).
- Bliss, T. V., Collingridge, G. L., Morris, R. G. I. n. t. r. o. d. u. c. t. i. o. n. Long-term potentiation and structure of the issue. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 358, 607-611 (2003).
- Shepherd, G. M. . The synaptic organization of the brain. , (2004).
- Malinow, R., Tsien, R. W. Presynaptic enhancement shown by whole-cell recordings of long-term potentiation in hippocampal slices. Nature. 346, 177-180 (1990).
- Malinow, R. Introduction of green fluorescent protein (GFP) into hippocampal neurons through viral infection. Cold Spring Harb Protoc. , (2010).
- Shi, S., Hayashi, Y., Esteban, J. A., Malinow, R. Subunit-specific rules governing AMPA receptor trafficking to synapses in hippocampal pyramidal neurons. Cell. 105, 331-343 (2001).
- Woods, G., Zito, K. Preparation of gene gun bullets and biolistic transfection of neurons in slice culture. J Vis Exp. , (2008).
- Esteban, J. A. PKA phosphorylation of AMPA receptor subunits controls synaptic trafficking underlying plasticity. Nat Neurosci. 6, 136-143 (2003).
- Mainen, Z. F. Two-photon imaging in living brain slices. Methods. 18, 231-239 (1999).
- Barria, A., Malinow, R. Subunit-specific NMDA receptor trafficking to synapses. Neuron. 35, 345-353 (2002).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 37, 173-182 (1991).
- Simoni, A. D. e., Griesinger, C. B., Edwards, F. A. Development of rat CA1 neurones in acute versus organotypic slices: role of experience in synaptic morphology and activity. J Physiol. 550, 135-147 (2003).
