La combinación de colorantes lipofílicos, In situ, inmunohistoquímica y la histología

1. Inyección de colorante lipofílico Preparación de tejidos: Todas las disecciones de los tejidos y las manipulaciones se llevan a cabo en animales fijados en el 4% de paraformaldehído (PFA) en tampón fosfato 0,1 M (pH 7,4) por perfusión transcardial con bombas peristálticas con agujas del tamaño adecuado. Los tejidos se pueden almacenar en PFA al 4% en el refrigerador hasta por 6 meses. Todos los preparativos y las manipulaciones se llevan a cabo en el 0,4% o superior PFA hasta el montaje con glicerol para la imagen. Esta cantidad de PFA elimina eficazmente RNasas y conserva el ARN de hibridación in situ. Tinte de almacenamiento: Todos los colorantes deben ser almacenados en un compartimiento oscuro cerradas para minimizar la circulación del aire y la exposición a la luz del día, ya que son fotosensibles. Para evitar la contaminación cruzada, un grupo separado de los instrumentos deben ser utilizados para manejar cada colorante. En primer lugar, un sitio de aplicación de la tinta debe ser elegido y se extrae tejido extraño para confirmar visualmente el sitio elegido, y el acceso para la colocación de la tinta. La elección del lugar de aplicación es el paso más importante en este proceso. La elección de un buen sitio para la etiqueta de la población de neuronas en cuestión y no las estructuras extrañas puede ser un desafío. La precisión de la colocación en una zona dada bajo control visual en el microscopio de disección requiere un cierto nivel de comprensión de la neuroanatomía en cuestión. Colorante o bien se puede colocar el centro o la periferia de la etiqueta proyecciones periférico o central, respectivamente, según sea necesario para un proyecto determinado (es decir, el cerebro, los nervios periféricos, oído, ojo). Colorantes Lipophic se difundirá en todos los procesos que pertenecen a una neurona determinada, tanto en forma retrógrada y anterógrada, llenando una neurona o neuronas todas proyectar en una pista determinada. NeuroVue tinte de MTTI viene pre-cargado en tiras de filtro para una fácil aplicación. Colorante también se puede disolver en 100% DMSO (trabajo bajo el capó) y el cabello fino puede ser empapado en esta solución y posteriormente se secó para aplicaciones más pequeñas. El tinte cargado papel de filtro se corta en trozos triangulares de tamaño adecuado con micro tijeras. El tamaño del medio de contraste depende del tamaño de la muestra, el tamaño de la estructura de ser etiquetado, y el número de colores que se utilizan simultáneamente. Asegúrese de cortar lo más pequeño de una pieza como sea posible para evitar el etiquetado de otras estructuras. Después de usar microsissors para el corte y pinzas para la manipulación de la tinta agitar los instrumentos en alcohol para eliminar cualquier residuo de tinte, luego seque completamente, o lenguado con papel. Esto es para evitar la contaminación de la muestra con un tinte residual en los instrumentos que pueden etiquetar las estructuras no deseadas. Para su inserción en los tejidos blandos como el cerebro del filtro puede ser insertado directamente con un punto del triángulo de filtro para perforar el tejido. Para más tejidos rígidos hacer una incisión para permitir la fácil inserción de tinta. No utilice una aguja de disección para impulsar filtro en el tejido. Esto puede causar la colocación incorrecta y alteración de los tejidos. Introduzca las longitudes de onda alternativa de NeuroVue tinte como sea necesario para el etiquetado de otras poblaciones neuronales. Después de insertar el medio de contraste y verificación de su posición, las muestras se colocan en un frasco bien cerrado con PFA al 4% y se incuba a 36 ° C en la oscuridad durante 2-14 días, dependiendo de la edad y la distancia de difusión a cubrir (de aproximadamente 2 mm por días a 36 ° C). Un microscopio de disección con epiflouresence se puede utilizar para evaluar si el colorante se ha difundido hasta la posición deseada, y la muestra puede ser colocado de nuevo en la incubadora, si la difusión se considera que es insuficiente. El uso de un ámbito normal de disección sin epifluorescene para detectar la difusión a subestimar la verdadera longitud del medio de contraste se ha difundido. Además, si la concentración de colorante es lo suficientemente alta como para evaluar visualmente que puede causar la absorción de enfriamiento cuando se utiliza la fluorescencia emitida. El tejido de interés deseado es disecado y todo ello montado en un portaobjetos con glicerol y cubreobjetos para obtener imágenes con un microscopio confocal. Configuración confocal son como se describe en 1, 2. Si el tamaño de los tejidos inhibe todo el montaje en una diapositiva, la sección de serie es necesario (ver más abajo). Más detalles sobre la preparación de tejido para la imagen y el tinte propiedades espectrales están disponibles en: http://www.mtarget.com/mtti/documents/NeuroVuebrochuremar2010.pdf Figura 1. Esquemática del experimento. El oído está expuesto para permitir la visualización de todas las estructuras. Colorante lipofílico se inyecta y se deja difusa. Después de la difusión de distintas poblaciones neuronales se puede ver la etiqueta de los tintes diferentes. A continuación, la hibridación in situ (Sox2) se realiza en el oído y la expresión de ARNm de las etiquetas. La inmunohistoquímica se realiza entonces(Myo7, tubulina) para visualizar la expresión de proteínas. Seguido por los cortes histológicos en el que tanto la hibridación in situ e inmunohistoquímica puede ser visualizada. 2. Hibridación in situ En caso de que desee comenzar con la hibridación in situ (después de que el rastreo con colorantes lipofílicos será imposible), se refieren a la preparación del tejido en la parte 1. Cada lavado, salvo que se indique, se lleva a cabo con 2 ml de solución a temperatura ambiente en un inversor / mezclador. Asegúrese de trabajar en un ambiente limpio, libre de RNasa. Deshidratar y rehidratar las muestras a través de una serie graduada de metanol. 100% 1 hora a la noche @ 4 ° C (opcional: conservar las muestras a -20 ° C en el 100% de metanol) 75% x 5 min. @ 4 ° C 50% x 5 min. @ 4 ° C 25% x 15 min. @ 4 ° C (o hasta que se hunde el tejido) Transferencia de muestras a un tubo de 2 ml eppendorf (RNasa libre). Lavar tres veces en PBS (1x PBS) y gire el horno de hibridación para su uso futuro (60 ° C). PBS x 5 min. PBS x 5 min. PBS x 5 min. Digerir el tejido con 2 l de 20 mg / ml de proteinasa K de valores (Cat. # AM2546 Ambion) en 2,0 ml PBS. El tiempo real de la digestión PK depende de la edad del embrión. La siguiente es una estimación aproximada de los tiempos. La digestión deben ser estrechamente vigilados como desproteinización es un paso crítico. En virtud de la digestión se traducirá en la penetración de la sonda pobres, mientras que más de la digestión se traducirá en una pérdida de integridad estructural. Un buen indicador de la digestión es un cambio en el tejido de opaco a transparente casi. Tabla 1. Proteinasa K tiempo de digestión de tejido de ratón. EDAD (días embrionarias) TIEMPO (minutos) E8.5 6 E9.5 10 E10.5 13 E11.5 15 E12.5 17 E14.5 18 E16.5 + 20 + Detener la digestión mediante la incubación de las muestras en PFA al 4% durante 5 min. Se lavan con PBS. PBS x 1 min. PBS x 5 min. PBS x 5 min. PBS x 5 min. Deseche PBS prestando especial atención a eliminar lo más posible. Prehybridize muestras: Se incuba a 60 ° C en el inversor en 1,8 ml de mezcla de hibridación durante al menos 1 hora. Juego de bloques IsoTemp calor a 85 ° C para su uso futuro. Como una hora se acerca, el ADN de esperma de salmón se desnaturalizan (Invitrogen Cat. No. 15632-011) por incubación a 85 ° C durante 10 min. Ubicado en hielo hasta su uso. Después de al menos 1 hora de prehibridación, añadir 200 l ssDNA desnaturalizado y aproximadamente 100 ng de la etiqueta DIG-riboprobe a cada muestra. Hibridación noche a 60 º C en horno de hibridación. Vuelva a colocar la mezcla de hibridación con 2 ml de 2X SSC. Establecer bloques IsoTemp calor a 37 ° C y 70 ° C para su uso futuro. Lavar con 2X SSC x 10 min. A 60 ° C en horno de hibridación. Lavar con 2X SSC x 10 min. A 60 ° C en horno de hibridación. Lavar con 2X SSC x 10 min. A 60 ° C en horno de hibridación. Lavar con 2X SSC x 60 min. 70 ° C en el bloque de calor IsoTemp. 70 ° C elimina cualquier actividad endógena de fosfatasa alcalina. Este es quizás el paso más significativo hacia la reducción de fondo. La parte (d) puede ser dividida en dos tiempos de 30 min. lava para minimizar el daño a los tejidos. Lavar con PBS x 5 min. Una enzima RNasa descongelar en hielo para su uso futuro. Vuelva a colocar PBS y añadir 1,0 l de RNasa una enzima (Fermentas EN0531 10 mg / ml) x 60 min. @ 37 ° C en el bloque de calor IsoTemp (a 90 min. Periodo de incubación es preferible si la sonda está altamente concentrada). Deseche PBS / RNasa A y lavar 4 veces. 1X solución de lavado x 10 min. 1X solución de lavado x 10 min. 1X solución de lavado x 10 min. 1X solución de lavado x 60 min. 70 ° C en el bloque de calor IsoTemp. Incubar en buffer de bloque 1X durante 1 hora. En este momento, preparar 2,0 mL de tampón de bloqueo y 1 l (1:2000) de anticuerpos anti-digoxigenina por muestra. Invertir brevemente y deje reposar a 4 ° C hasta su uso. Después de una hora de búfer bloque de descarte y añadir 2,0 ml antes de la absorción de búfer + bloque de anticuerpos a las muestras. Incubar toda la noche. Desechar la solución del bloque. Lavar con tampón de lavado 1X. 1X tampón de lavado x 5 min. 1X tampón de lavado x 5 min. 1X tampón de lavado durante 1 hora x 5.6 los cambios. Lavar con tampón de lavado 1X durante la noche. Enjuague con 1X Detection tampón durante 10 minutos. Transferencia de las muestras en tampón de detección de la placa también. Quitar búfer y detectar con BM púrpura (Roche 11442074001) hasta que la fuerza deseada de la señal se obtiene (con sondas más largas, esto puede significar la noche). BM púrpura es sensible a la luz la cubierta con papel de aluminio o una caja. Mezcla BM Purple bien antes de usar. Asegúrese de que las muestras son de libre flotación y no salió en los pozos. Compruebe la señal después de 1 hora. Muestras de enjuague con tampón 1X en la detección de pozos x 5 min. Imagen o conservar las muestras en PFA al 4% a 4 ° C. * Las muestras se pueden visualizar en esta etapa y / o después del paso de inmunohistoquímica se añade (Parte 3). Soluciones: Nucleasa libre de agua: Mezclar 1 ml de DEPC (Sigma) con 1 litro de agua ultrapura estéril. Autoclave. 1X PBS: Mezcle 1 paquete de PBS (Sigma) en 1 litro de agua libre de nucleasa y el filtro de esterilización. Las soluciones de lavado 1X: Mezclar 450 ml de agua libre de nucleasa + 50 ml de solución de lavado 10X y filtro de esterilización. Mezclar la hibridación: formamida al 50% en volumen (25 ml), el 50% 2X SSC por volumen (25 ml), 6% de sulfato de dextrano en masa (3G). 1X tampón de detección: Mezclar 50 ml de tampón de detección de 10 veces con 450 ml de agua libre de nucleasa y el filtro de esterilización. 1X buffer de bloque: 5 ml de 10X Buffer ácido maleico (Roche juego de tampones), 40 ml de agua libre de nucleasa, 5 ml de tampón 10X bloque. 2X SSC: Mezclar 50 ml de 20X SSC con 450 ml de agua libre de nucleasa y el filtro de esterilización. Metanol clasificados: Diluir 100% de metanol con agua libre de nucleasa al 75%, 50%, y las concentraciones de 25%. 3. Inmunohistoquímica Los pasos 1 y 2 se pueden omitir si se completó la Parte 2. En ese caso, asegúrese de que todos los glicerol u otro medio de montaje se lava. Tenga en cuenta que no todos los anticuerpos todavía será capaz de detectar su epítopo después de digestión con proteinasa K. Tenemos una lista corta de los anticuerpos que se pueden utilizar en combinación con la hibridación in situ en tejidos de mamíferos, ya que conservan su especificidad (ver Tabla 2). Series de etanol escalonadas para eliminar el tejido de los colorantes lipofílicos (si no se completa a efecto en la Parte 2):.. 50% 5 minutos de etanol, etanol al 70% 5 min, 95 a 100% de etanol durante la noche o cuando sea necesario hasta que el efecto deseado, etanol al 70% 5 min., el 50% de etanol 5 minutos. Rehidratar mediante la adición incremental PBS en 5-10 minutos. Bloque de tejido durante 1 hora en el 2,5% suero normal de cabra (NGS) y el 0,5% Triton X-100 @ RT en la coctelera. (01:01 NGS 5%: 1,0% TritonX-100 en PBS 1x) Incubar con el anticuerpo primario (s) diluido en solución de bloqueo 48-72 horas con 4 ° C en el agitador. Lavar con PBS durante 1 hora x 3 cambios. Bloque como en el paso 3. Se incuba con el anticuerpo secundario (s) diluido en solución de bloqueo durante 12-24hrs @ 4 ° C en el agitador (Alexa Fluor ® tintes de Invitrogen se utilizaron). Lavar como en el paso 5. (Opción:.. Contador de mancha con Hoechst tinción nuclear como primer lavado diluida de 10 mg / ml de caldo de 1:2000 en PBS con 1 hora Siga lavados en PBS 3.2 x RT @ cambios en la coctelera) Imágenes: Las muestras se pueden visualizar en esta etapa con la transmisión y microscopía de epifluorescencia, preferentemente mediante un sistema de visualización de imagen confocal de mayor resolución. Para hacer esto de manera rutinaria los oídos todo el montaje en glicerol con cubreobjetos como separadores para evitar el exceso de compresión de los tejidos. Además o en lugar de todo este montaje de imágenes, las muestras pueden ser embebido en resina de epoxi y seriados para mayor detalles histológicos. Para beneficiarse de la combinación de todo el montaje / sección de análisis, evitar el blanqueo de la señal fluorescente en el paso de la imagen confocal. Soluciones Soluciones de etanol: Diluir 100% de etanol en agua destilada a la concentración final del 50% y 70%. Solución bloque: 01:01 NGS dilución del 5%: 1,0% TritonX-100 en PBS 1x (concentraciones finales de trabajo: NGS 2,5%, 0,5% TritonX-100). 1X PBS: Mezcle 1 paquete de PBS (Sigma) en agua destilada 1 litro. NGS 5%: 2,5 deshielo NGS mL y se mezclan con 47,5 ml de PBS 1x. Almacenar a 4 ° C. 1,0% TritonX-100: Mezclar 49,5 ml 1x PBS con 0,5 ml TritonX-100 (dejar el agitador @ RT para mezclar durante 1 hora). Almacenar a 4 ° C. Hoechst solución madre mancha: Disolver 10 mg Hoechst por mililitro de 1x PBS. Tabla 2. Anticuerpos que trabajan con proteinasa K tejido digerido. Cat # Artículo Vender 25-6790 Anti-miosina VIIA policlonales Proteus Biosciences 25-6791 Anti-miosina VI policlonales Proteus Biosciences 9661 Exfoliados caspasa-3 policlonales Señalización Celular T7451 Anti-tubulina acetilada Monoclonal Sigma PRB-238C Policlonal PROX1 Covance 4. Histología La histología puede ser introducido después de la Parte 1 para aumentar la resolución del colorante lipofílico de búsqueda en gruesos soportes de todo, como el cerebro de menores o después de la finalización de las partes 2 y 3. Para las secciones de cerebro de serie se recomienda el Compresstome VF-700 microtomo (Precisionary Instruments Inc., Greenville, Carolina del Norte) para obtener el espesor de corte uniforme. Las secciones congeladas son menos óptimas debido a una mayor fuga de colorante durante el proceso de corte 3. Preparación de las secciones de serie y de montaje en glicerol 4 es el método preferido de preparación de los tejidos cuando se monta todo o montajes de superficie no permiten una adecuada visualización de las regiones de tejido de interés. El tejido también se puede posteriormente ser embebido en resina de epoxi y corte con un espesor de 1.2 micras con cuchillas de vidrio o de diamante para TEM. Cuando se utiliza esta técnica de inmunofluorescencia más seguirá siendo y es aún más estable después de la incorporación de plástico, sin embargo, todos los lipofílicos trazado será totalmente perdido en esta etapa ya que se disuelven en la resina de epoxy y alcohol. Tome la precaución como muestras serán sensibles a la luz hasta que estén integrados. Para Compresstome corte microtomo VF-700, siga las recomendaciones de Precisionary Inc. Instrumentos Epoxi Inclusión / seccionamiento: Fijación: 2,5% glutaraldehído / 1% de PFA en 0,1 M de tampón fosfato (pH 7,4) 1 hora de la noche. En una muestra de tejido de vidrio deshidratar vial: 30% de etanol (5min.), el 50% de etanol (5min.), el 70% de etanol (5min. a la noche), el 95% de etanol (10 minutos 5 veces cada uno.) Y etanol absoluto (10 minutos 5 veces . cada uno). De transición del disolvente: 01:01 etanol absoluto: óxido de propileno (PO) durante 5 min. Disolvente: 10min PO sólo 5 veces. cada uno. La infiltración con resina: 01:01 PO: durante la noche de resina en la coctelera. Vierta la solución con la muestra (s) en el molde incorporación plana y dejar en la lucha contra las 4-6 horas para evaporar el PO. Como alternativa, retire la tapa del frasco y dejar en agitación durante 4 horas (funciona bien con mayor tejido). Transferencia de muestras de resina 100% durante 4 horas. Insertar en la resina en el molde final con la etiqueta. Polimerizan mediante la incubación a 60 ° C durante 24-48 horas. Corte de bloques con una cuchilla de afeitar, según sea necesario para reducir al mínimo la resina extraños. Cortar secciones de 1-2 um de serie en un ultramicrótomo (un E Ultracut Reichert-Jung fue utilizado). Montaje y la imagen por microscopía de epifluorescencia. Opcional: Mancha una parte de las secciones con tinciones histológicas (azul, es decir Stevenel es) si lo desea (cuenta de inmunofluorescencia no se sostendrá en las siguientes secciones). Soluciones Soluciones de etanol: Diluir 100% de etanol en agua destilada a 30%, 50%, 70% y 95% las concentraciones. Solución de fijación: Mezclar 2,5 ml de glutaraldehído al 50%, 5 ml de paraformaldehído al 10%, y 42,5 ml de 0,1 M tampón fosfato pH 7,4 (concentración final: 2,5% glutaraldehído, 4% PFA). Almacenar a 4 ° C. Resina epoxi: Haga de acuerdo con las instrucciones suministradas con Poly / Habitación 812 incrustación Media/DMP-30 Kit (Polysciences, Inc. # 08792-1). Almacenar a -20 ° C. 5. Resultados representante Figura 2. Colocación lipofílicas tinte y de imagen en un embrión de ratón. Tres colorantes lipofílicos longitud de onda diferentes se inyecta y se incuban para permitir la visualización del nervio trigémino (NT), nervio glosofaríngeo (GN), y el nervio vago (VN) proyecciones centrales. A) la colocación de colorante lipofílico en las partes periféricas de tres nervios craneales para permitir la difusión en el tronco cerebral para la visualización de sus procesos centrales. El TN se etiqueta con NeuroVue Red, GN: Maroon NeurVue y VN: Jade NeuroVue. B) Lo mismo que en el ratón (A) después de la incubación. Algunos de difusión pueden ser vistos con el microscopio de campo claro. C) Igual que en el ratón (A y B). El cerebro posterior se ha dividido y se monta plana. Algunos de etiquetado de los procesos centrales de los tres nervios marcados se pueden ver con microscopio campo claro. D) la imagen confocal (C). Con el uso de las neuronas específicas confocal se puede ver, y el uso de tres diferentes tintes permite la evaluación de la distribución de cada población en relación con los demás. Colorantes fueron estudiados de forma secuencial. Jade NeuroVue fue fotografiada en una excitación de 488 nm y de emisión de 500-550 nm. NeuroVue Red fue fotografiada en una excitación de 535 nm y de emisión de 550-600 nm. Maroon NeuroVue fue fotografiada en una excitación de 643 nm y emisión a 650-700 nm. Figura 3. Esquema de las experimento. El oído está expuesto para permitir la visualización de todas las estructuras. Colorante lipofílico esLuego se inyecta y se deja difusa. Después de la difusión de distintas poblaciones neuronales se puede ver la etiqueta de los tintes diferentes. A continuación, la hibridación in situ (Sox2) se realiza en el oído y la expresión de ARNm de las etiquetas. La inmunohistoquímica se realiza entonces (Myo7, tubulina) para visualizar la expresión de proteínas. Seguido por los cortes histológicos en el que tanto la hibridación in situ e inmunohistoquímica puede ser visualizada.