الجمع بين صبغ محبة للدهون ، في الموقع التهجين ، المناعية ، والأنسجة
Summary
وتقدم مجموعة من التقنيات المختلفة لتعظيم جمع البيانات من الأنسجة الماوس.
Abstract
تجاوز وظيفة جينة واحدة لقطع أعمق في شبكات الجينات التنظيمية يتطلب تحولات متعددة مجتمعة في حيوان واحد. مثل هذا التحليل من اثنين أو أكثر من الجينات تحتاج إلى أن تستكمل مع التهجين في الموضع الطبيعي للجينات أخرى ، أو من البروتينات المناعية الخاصة بهم ، سواء في أجهزة محمولة كلها النامية أو أقسام لتحليل مفصل للتعديلات التعبير الخلوية والأنسجة. الجمع بين عدة جينات التعديلات يتطلب استخدام لجنة المساواة العرقية أو لحذف flipase مشروط الجينات وتجنب الفتك الجنينية. المخططات المطلوبة تربية تعزز على نحو مثير الجهد والتكاليف بما يتناسب مع عدد من الجينات المتحولة ، مع نتائج قليلة جدا من الحيوانات مع ذخيرة كاملة من التعديلات الوراثية المطلوبة. إطفاء الكم الهائل من الجهد والوقت للحصول على هذه العينات القليلة الثمينة التي تحمل طفرات متعددة يتطلب التحسين الأنسجة. وعلاوة على ذلك ، والتحقيق في حيوان واحد مع تقنيات متعددة يجعل من السهل ربط عيوب الجينات الحذف مع التشكيلات التعبير. قمنا بتطوير تقنية للحصول على مزيد من التحليل الدقيق لحيوان معين ، مع القدرة على تحليل العديد من مختلف هياكل معترف بها تشريحيا وكذلك الجينات والبروتينات التعبير عن نفسه من العينة في كل من الأجهزة كلها صحيحة والمقاطع. على الرغم من أن الفئران قد استخدمت للتدليل على فعالية هذه التقنية يمكن تطبيقها على مجموعة واسعة من الحيوانات. للقيام بذلك جمعنا محبة للدهون صبغ تتبع جبل بأكمله في الموقع التهجين ، المناعية ، والأنسجة لاستخراج أقصى كمية ممكنة من البيانات.
Protocol
1. صبغ حقن محبة للدهون نسيج التحضير : تنفذ جميع تشريح الانسجة والتلاعب في الحيوانات ثابتة في بارافورمالدهيد 4 ٪ (PFA) في 0.1 م العازلة الفوسفات (درجة الحموضة 7.4) عن طريق استخدام مضخات نضح transcardial تمعجية مع الإبر بحجم مناسب. يمكن تخزينها في الأنسجة PFA 4 ٪ في الثلاجة لمدة تصل إلى 6 أشهر. وتجرى جميع الاستعدادات والتلاعب في 0.4 ٪ أو أعلى حتى PFA المتصاعد مع الجلسرين للتصوير. هذا المبلغ من PFA يلغي فعليا RNases ويحافظ على الحمض النووي الريبي لتهجين في الموضع. صبغ التخزين : يجب أن يتم تخزين جميع الأصباغ في حجرة مظلمة ومقفلة للحد من دوران الهواء والتعرض لضوء النهار الساطع ، لأنها حساسة للضوء. لتجنب التلوث المتبادل ، يجب استخدام مجموعة منفصلة من الأدوات لمعالجة كل صباغة. أولا ، يجب اختيار موقع للتطبيق للصباغة النسيج واستخراج دخيلة من أجل تأكيد بصريا موقع المختار ، والوصول لوضع الصبغة. اختيار موقع التطبيق هو أهم خطوة في هذه العملية. اختيار موقع جيد لتسمية السكان العصبية قيد النظر وليس هياكل دخيلة يمكن أن يكون تحديا. دقة موضع في المسالك يعطى تحت المراقبة البصرية في نطاق تشريح يتطلب مستوى معين من فهم التشريح العصبي في السؤال. يمكن صبغ إما أن توضع مركزيا أو محيطيا لتسمية التوقعات الطرفية أو المركزية كما التوالي اللازمة لمشروع معين (أي المخ والأعصاب الطرفية والأذن والعين). والأصباغ Lipophic منتشر في جميع العمليات بالانتماء الى خلية عصبية معينة ، وسواء retrogradely anterogradely ، وملء الخلايا العصبيه معين أو إسقاط جميع الخلايا العصبية في مسار معين. NeuroVue الصبغة من MTTI تأتي محملة مسبقا على شرائط تصفية سهلة التطبيق. ويمكن أيضا أن تكون الصبغة الذائبة في DMSO 100 ٪ (العمل تحت غطاء محرك السيارة) ، ويمكن أن تكون غارقة الشعر رقيقة في هذا الحل وتجفيفها لاحقا لأصغر التطبيقات. هو قطع مسبقة صبغ رقة الترشيح الى قطع بحجم مناسب مع الثلاثي microscissors. فإن حجم الصبغة يعتمد على حجم العينة ، وحجم الهيكل وصمها ، وعدد الألوان المستخدمة في وقت واحد. يجب التأكد من قطع صغيرة من قطعة ممكن لتجنب وضع العلامات غيرها من الهياكل. بعد استخدام microsissors لتقطيع وملقط للتعامل مع الصبغة تستنهض الهمم للصكوك في الكحول لإزالة أي بقايا صباغة ، ثم الهواء الجاف تماما ، أو الداب مع الورق. هذا هو لتجنب تلوث العينات مع الصبغة المتبقية على الصكوك التي قد تسمية الهياكل غير المرغوب فيها. ويمكن إدراجها في الأنسجة اللينة مثل الدماغ وتصفية تدرج مباشرة باستخدام نقطة من المثلث مرشح لاختراق النسيج. لأنسجة أكثر جمودا إجراء شق للسماح الإدراج أسهل من الصبغة. لا تستخدم إبرة تشريح لدفع مرشح في الأنسجة. يمكن أن يسبب هذا التنسيب غير دقيقة والتعطيل من الأنسجة. ادخال موجات بديلة لصبغ NeuroVue حسب الحاجة لوضع العلامات من السكان العصبية إضافية. بعد إدراج الصبغة ، والتحقق من موقفها ، وتوضع العينات في قارورة مغلقة بإحكام مع PFA 4 ٪ والمحتضنة في 36 درجة مئوية في الظلام لمدة 2-14 أيام تبعا للعمر والمسافة التي يجب تغطيتها نشر (حوالي 2 مم في اليوم عند 36 درجة مئوية). ويمكن استخدام نطاق تشريح مع epiflouresence لتقييم ما إذا كانت الصبغة قد ضعف إلى الموقع المطلوب ، ويمكن أن توضع العينة مرة أخرى في حاضنة إذا اعتبر نشر غير كافية. وسوف تستخدم النطاق العادي من دون تشريح epifluorescene للكشف عن نشر نقلل من طول الحقيقية الصبغة قد ضعف. أيضا ، إذا كان تركيز صبغ عالية بما يكفي لتقويم البصر قد يسبب تبريد الامتصاص عند استخدام مضان المنبعثة. يتم تشريح النسيج المطلوب من الاهتمام بها وكلها محمولة على شريحة مع الجلسرين وcoverslipped للتصوير مع المجهر مبائر. وكما هو موضح في الإعدادات مبائر 2 ، 1. إذا كان حجم الأنسجة يمنع كله على شريحة متزايدة ، وهناك حاجة sectioning التسلسلي (أنظر أدناه). مزيد من التفاصيل حول التحضير لتصوير الأنسجة والخصائص الطيفية صبغ متوفرة في : http://www.mtarget.com/mtti/documents/NeuroVuebrochuremar2010.pdf الشكل 1. نظرة عامة على ما يتعرض التخطيطي للتجربة. الأذن للسماح لرؤية جميع الهياكل. ثم يتم حقن صبغة محبة للدهون ، وسمح لنزع فتيل. ويمكن أن ينظر إليه بعد نشر السكان العصبية المسماة متميزة من الأصباغ المختلفة. المقبل ، في الموقع التهجين (Sox2) يتم تنفيذها على الأذن والتسميات التعبير مرنا. ويتم من ثم المناعية(Myo7 ، تويولين) لتصور بروتين تعبير. تليها قطاعات النسيجية والتي على حد سواء في الموقع التهجين والمناعية يمكن تصور. 2. في الموقع التهجين في حال كنت تريد أن تبدأ في تهجين الموقع (وبعد ذلك تتبع مع الأصباغ محبة للدهون وسوف يكون من المستحيل) ، تشير إلى إعداد الأنسجة في الجزء 1. كل الغسيل ، ما لم يرد ، ونفذت مع 2 مل من محلول في درجة حرارة الغرفة على العاكس / خلاط. احرص على العمل في بيئة نظيفة ريبونوكلياز ، مجانا. يذوى ثم ترطيب عينات من خلال سلسلة الميثانول متدرج. 100 ٪ 1 ساعة ليلة وضحاها @ 4 درجات مئوية (اختياري : عينات المحل في -20 درجة مئوية في الميثانول 100 ٪) 75 ٪ × 5 دقائق. @ 4 درجات مئوية 50 ٪ × 5 دقائق. @ 4 درجات مئوية 25 ٪ × 15 دقيقة. @ 4 درجات مئوية (أو حتى البواليع الأنسجة) نقل العينات إلى أنبوب إيبندورف 2 مل (ريبونوكلياز مجانا). يغسل ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني (1X PBS) وبدوره الفرن على التهجين لاستخدامها في المستقبل (60 درجة مئوية). PBS × 5 دقيقة. PBS × 5 دقيقة. PBS × 5 دقيقة. هضم الأنسجة مع 2 ميكرولتر من 20mg / مل K بروتيناز الأسهم (Ambion القط # AM2546) في برنامج تلفزيوني جديد 2.0 مل. الوقت الفعلي PK الهضم يعتمد على عمر الجنين. وفيما يلي تقدير تقريبي من المرات. وينبغي أن تراقب عن كثب عملية الهضم كما deproteination هو خطوة حاسمة. وتحت الهضم نتيجة التحقيق في اختراق الفقراء بينما الإفراط في الهضم ويؤدي إلى فقدان السلامة الهيكلية. وهناك مؤشر جيد للهضم هو تغيير في النسيج من مبهمة واضحة تقريبا. الجدول 1. بروتين الهضم وقت كاف على أنسجة الماوس. AGE (اليوم الجنينية) TIME (دقيقة) E8.5 6 E9.5 10 E10.5 13 E11.5 15 E12.5 17 E14.5 18 E16.5 + 20 + توقف عملية الهضم التي يحتضنها العينات في PFA 4 ٪ لمدة 5 دقائق. يغسل في برنامج تلفزيوني. PBS × 1 دقيقة. PBS × 5 دقيقة. PBS × 5 دقيقة. PBS × 5 دقيقة. تجاهل برنامج تلفزيوني مع إيلاء اهتمام خاص للقضاء على أكبر قدر ممكن. Prehybridize العينات : احتضان عند 60 درجة مئوية على العاكس في 1.8 مل من مزيج تهجين ما لا يقل عن 1 ساعة. تعيين كتلة IsoTemp الحرارة إلى 85 درجة مئوية لاستخدامها في المستقبل. كما تقترب من ساعة واحدة ، تفسد الحمض النووي الحيوانات المنوية السلمون (Invitrogen القط رقم 15632-011) من الحضانة في 85 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. تعيين على الجليد حتى الاستخدام. بعد ما لا يقل عن 1 ساعة prehybridization ، إضافة 200 ssDNA التشويه والتحريف وميكرولتر 100ng تقريبا DIG المسمى riboprobe على كل عينة. هجن بين عشية وضحاها في 60 درجة مئوية في فرن التهجين. استبدال مزيج التهجين مع 2 مل SSC 2X. مجموعة كتل IsoTemp الحرارة إلى 37 درجة مئوية و 70 درجة مئوية لاستخدامها في المستقبل. يغسل مع SSC 2X 10 دقيقة س. @ 60 درجة مئوية في فرن التهجين. يغسل مع SSC 2X 10 دقيقة س. @ 60 درجة مئوية في فرن التهجين. يغسل مع SSC 2X 10 دقيقة س. @ 60 درجة مئوية في فرن التهجين. يغسل مع SSC 2X 60 دقيقة س. @ 70 درجة مئوية في حرارة كتلة IsoTemp. 70 درجة مئوية يزيل أي نشاط الذاتية الفوسفاتيز القلوية. هذا هو ربما أهم خطوة نحو الحد من الخلفية. ويمكن تقسيم الجزء (د) في 30 دقيقة اثنين. يغسل للحد من الأضرار التي لحقت الأنسجة. غسل دقيقة مع PBS 5 ×. أذاب ريبونوكلياز انزيم على الجليد لاستخدامها في المستقبل. استبدال برنامج تلفزيوني وإضافة 1.0 ميكرولتر من أنزيم A ريبونوكلياز (Fermentas EN0531 10mg / مل) × 60 دقيقة. @ 37 درجة مئوية في حرارة كتلة IsoTemp (ويفضل 90 دقيقة. فترة الحضانة إذا يتركز التحقيق للغاية). تجاهل PBS / ريبونوكلياز ألف وتغسل 4 مرات. 1X حل غسل × 10 دقيقة. 1X حل غسل × 10 دقيقة. 1X حل غسل × 10 دقيقة. 1X حل غسل × 60 دقيقة. @ 70 درجة مئوية في حرارة كتلة IsoTemp. احتضان المخزن في كتلة 1X لمدة 1 ساعة. في هذا الوقت ، وإعداد 2.0 مل من كتلة عازلة و 1 ميكرولتر (1:2000) المضادة للDigoxigenin الأضداد في العينة. عكس لفترة وجيزة وترك الجلوس في 4 حتى استخدام درجة مئوية. بعد 1 ساعة تجاهل كتلة عازلة وإضافة 2.0 مل كتلة عازلة قبل امتصاصها + الأجسام المضادة لعينات. يحضن بين عشية وضحاها. تجاهل حل كتلة. غسل يغسل العازلة مع 1X. 1X غسل العازلة × 5 دقيقة. 1X غسل العازلة × 5 دقيقة. 1X العازلة يغسل لمدة 1 ساعة العاشر 5-6 التغييرات. غسل يغسل العازلة مع 1X بين عشية وضحاها. التشطيف مع detectio 1Xن العازلة لمدة 10 دقيقة. نقل العينات في الكشف لوحة العازلة جيدا. وكشف إزالة العازلة مع بيربل BM (روش 11442074001) حتى يتم الحصول على قوة الإشارة المطلوب (مع تحقيقات يعد هذا قد يعني بين عشية وضحاها). BM الأرجواني هو تغطية الحساسة للضوء أو مع علبة رقائق. مزيج BM بيربل جيدا قبل الاستعمال. تأكد من أن تطفو عينات مجانية وليس تمسك الآبار. إشارة الاختيار بعد 1 ساعة. شطف عينات العازلة مع الكشف 1X في الآبار دقيقة 5 ×. الصورة أو تخزين العينات في PFA 4 ٪ عند 4 درجات مئوية. * يمكن تصوير العينات في هذه المرحلة و / أو بعد خطوة المناعية يضاف (الجزء 3 أدناه). الحلول : Nuclease مجانا الماء : 1 مل DEPC ميكس (سيغما) مع الماء عالى النقاء 1L العقيمة. الأوتوكلاف. 1X PBS : اخلطي 1 PBS الحزمة (سيغما) في المياه 1L مجانا nuclease تعقيم وتصفية. 1X حل اغسل : 450 مل ميكس المياه مجانا nuclease + 50 مل من محلول الغسيل 10x وتصفية تعقيم. ميكس التهجين : Formamide 50 ٪ من حجم (25 مل) ، و 50 ٪ من حجم التعاون بين بلدان الجنوب 2X (25 مل) ، 6 ٪ من الكتلة كبريتات ديكستران (3G). 1X الاحتياطي كشفها : مزيج 50 مل العازلة الكشف 10X مع 450 مليلتر من الماء مجانا وتصفية nuclease تعقيم. 1X الاحتياطي بلوك : 5 مل 10X الاحتياطي حمض المالئيك (روش العازلة مجموعة) ، و 40 مل من المياه مجانا nuclease ؛ 5 مخزن مل بلوك 10X. 2X SSC : مزيج 50 مل 20X SSC مع 450 مليلتر من الماء مجانا وتصفية nuclease تعقيم. الميثانول متدرج : خفف الميثانول بنسبة 100 ٪ مع الماء nuclease الحرة إلى 75 ٪ ، 50 ٪ ، وتركيز 25 ٪. 3. المناعية ويمكن حذف الخطوات 1 و 2 إذا اكتمل الجزء 2. في هذه الحالة ، تأكد من أن يتم غسلها عن الجلسرين أو غيرها المتوسطة المتزايدة قبالة. علما بأن ليس كل الأجسام المضادة سوف تكون لا تزال قادرة على كشف حاتمة بهم بعد الهضم K بروتين. لدينا قائمة قصيرة من الأجسام المضادة التي يمكن أن تستخدم في تركيبة مع التهجين في الموقع في أنسجة الثدييات كما أنها تحتفظ خصوصيتها (انظر الجدول 2). سلسلة متدرجة الايثانول لتخليص النسيج الأصباغ محبة للدهون (إذا لم يكتمل إلى التأثير في جزء 2) :. 5min الايثانول 50 ٪ ، 70 ٪ من الإيثانول 5 دقائق ، والإيثانول 95-100 ٪ بين عشية وضحاها أو حسب الحاجة حتى التأثير المطلوب ، والإيثانول 70 ٪ 5 دقيقة ، و 50 ٪ 5min الايثانول. ترطيب بشكل متزايد عن طريق إضافة برنامج تلفزيوني في 5-10 دقائق. كتلة الأنسجة لمدة 1 ساعة في 2.5 ٪ مصل الماعز العادي (خ ع) و 0.5 ٪ تريتون X – 100 @ RT على شاكر. (1:1 NGS 5 ٪ : 1.0 ٪ TritonX – 100 في برنامج تلفزيوني 1X) احتضان مع الأجسام المضادة الأولية (ق) في المحلول المخفف كتلة 48-72 ساعة @ 4 درجات مئوية على شاكر. يغسل مع برنامج تلفزيوني عن التغييرات 1hr 3 س. كتلة كما في الخطوة 3. احتضان مع الأجسام المضادة الثانوية (ق) في محلول مخفف للكتلة 24hrs – 12 @ 4 درجات مئوية على شاكر (فلور اليكسا استخدمت الأصباغ من Invitrogen ®). يغسل كما في الخطوة 5. (الخيار :.. مواجهة نووية مع وصمة عار وصمة عار كما يغسل هويشت first تمييع 10mg / مل 1:2000 الأسهم في برنامج تلفزيوني اتبع مع 1 ساعة يغسل PBS 2-3 في x @ RT تغييرات على شاكر) تصوير : يمكن تصوير العينات في هذه الخطوة مع كل من الإرسال وepifluorescent المجهري ، وذلك باستخدام نظام تفضيلي لقرار التصوير مبائر المضافة. للقيام بذلك بشكل روتيني ونحن آذان جبل بأكمله في استخدام الجلسرين coverslips والفواصل لتجنب ضغط على الأنسجة. في إضافة أو بدلا من هذا كله يمكن أن يشن التصوير ، تكون جزءا لا يتجزأ العينات في راتنجات الايبوكسي ومقطوع متسلسل للحصول على التفاصيل النسيجية المضافة. للاستفادة من تحليل جبل / قسم كامل مجتمعة ، وتجنب الإشارة الفلورسنت تبييض في الخطوة مبائر التصوير. الحلول حلول الايثانول : خفف الإيثانول بنسبة 100 ٪ في الماء المقطر لتركيزات النهائي من 50 ٪ و 70 ٪. الحل كتلة : NGS تخفيف 01:01 5 ٪ : 1.0 ٪ TritonX – 100 في برنامج تلفزيوني 1X (نهائي تركيزات العمل : NGS 2.5 ٪ ؛ 0.5 ٪ TritonX – 100). 1X PBS : اخلطي 1 PBS الحزمة (سيغما) في الماء المقطر 1L. خ ع 5 ٪ : 2.5 مل NGS الذوبان والاختلاط مع 47.5 مل 1X PBS. المحل في 4 درجات مئوية. 1.0 ٪ TritonX – 100 : مزيج 49.5 مل 1X PBS مع 0.5 مل TritonX – 100 (على مغادرة شاكر @ RT لخلط لمدة 1 ساعة). المحل في 4 درجات مئوية. هويشت محلول المخزون وصمة عار : ذوب 10mg هويشت صبغ في الملليمتر الواحد من 1X PBS. الجدول 2. الأجسام المضادة التي تعمل مع الأنسجة K بروتين مهضوم. القط # بند Vender 25-6790 مكافحة الميوسين – VIIA النسائل المتعددة العلوم البيولوجية المتقلبة 25-6791 مكافحة الميوسين إلى السادس النسائل المتعددة العلوم البيولوجية المتقلبة 9661 المشقوق كاسباس 3 النسائل المتعددة خلية اشارة T7451 مكافحة الأسيتيل تويولين Monoclonبن سيغما PRB – 238C النسائل المتعددة Prox1 كوفانس 4. الأنسجة ويمكن إدخال جزء 1 الأنسجة بعد قرار لزيادة الصبغة محبة للدهون في البحث عن المفقودين يتصاعد كله سميكة مثل أدمغة الأحداث أو بعد الانتهاء من قطع غيار 2 أو 3. لأقسام الدماغ المسلسل نوصي VF – 700 Compresstome مشراح (Precisionary الآلات ، وشركة غرينفيل ، كارولينا الشمالية) للحصول على الزي سمك الباب. أقسام المجمدة هي أقل الأمثل بسبب تسرب صبغة أكبر خلال عملية sectioning 3. إعداد الأبواب المسلسل والمتصاعد في الجلسرين 4 هو الأسلوب المفضل لإعداد الأنسجة عندما يتصاعد يتصاعد كليا أو السطحية لا تسمح التصور الملائم للمناطق الأنسجة من الاهتمام. ويمكن أيضا نسيج لاحقا جزءا لا يتجزأ من راتنجات الايبوكسي وقطع سمك ميكرومتر 1-2 في استخدام الزجاج أو السكاكين الماس لTEM. عند استخدام هذه التقنية الأكثر المناعي ستبقى وأكثر استقرارا بعد تضمين البلاستيك ، ومع ذلك ، سيتم تعقب كل محبة للدهون فقدت تماما في هذه المرحلة لأنها تذوب في الكحول وراتنجات الايبوكسي. اتخاذ الاحتياطات كعينات وسيتم الحساسة للضوء حتى تضمهم. لVF – 700 Compresstome sectioning مشراح ، اتبع توصيات لشركة الصكوك Precisionary الايبوكسي تضمينها / Sectioning : التثبيت : 2.5 ٪ gluteraldehyde / PFA 1 ٪ في 0.1M العازلة الفوسفات (درجة الحموضة 7.4) 1hr ليلة وضحاها. في نسيج عينة الزجاج يذوى فيال : الإيثانول بنسبة 30 ٪ (5min.) ، والإيثانول 50 ٪ (5min.) ، والإيثانول 70 ٪ (5min. ليلة وضحاها) ، والإيثانول 95 ٪ (كل 10min 5X) ، والإيثانول المطلق (10min 5X . لكل منهما). المذيبات الانتقالية : 1:1 الايثانول المطلق : أكسيد البروبيلين (ص) لمدة 5 دقائق. المذيب : ص 10min 5X فقط. لكل منهما. تسلل مع الراتنج : 1:01 ص : بين عشية وضحاها على راتنج شاكر. من أجل حل مع نموذج (ق) في قالب دمج مسطحة ويغادر يوم 4-6 ساعات حتى تتبخر مكافحة ص. بدلا من ذلك ، إزالة غطاء من القنينة وتترك على لمدة 4 ساعات شاكر (يعمل بشكل جيد مع أكبر الأنسجة). نقل العينات إلى راتنج 100 ٪ لمدة 4 ساعات. تضمين في الراتنج في قالب نهائي مع التسمية. تتبلمر التي يحتضنها في 60 درجة مئوية ل24-48 ساعة. خفض كتلة بشفرة الحلاقة حسب الحاجة للحد من راتنج دخيلة. قطع 1-2 المقاطع المسلسل أم على مشراح مستدق (تم استخدام البريد Ultracut رايشرت جونغ). جبل والصورة باستخدام المجهر epifluorescent. اختياري : اللطخة جزء من المقاطع مع البقع النسيجية (الأزرق في أي Stevenel) إذا كان المطلوب (لن يتم تحقيق المناعي أن يستمر في هذه المقاطع). الحلول حلول الايثانول : خفف الإيثانول بنسبة 100 ٪ في الماء المقطر إلى 30 ٪ ، 50 ٪ ، 70 ٪ ، وتركيزات 95 ٪. الحل التثبيت : Gluteraldehyde ميكس 2.5 مل من 50 ٪ ، 5 مل لامتصاص العرق 10 ٪ ، و 42.5 مل العازلة الفوسفات 0.1M 7.4 درجة الحموضة (تركيزات النهائي : gluteraldehyde 2.5 ٪ و 4 ٪ PFA). المحل في 4 درجات مئوية. راتنجات الايبوكسي : اصنع بحسب التعليمات المرفقة مع / 812 سرير بولي كيت Media/DMP-30 تضمينها (Polysciences ، وشركة # 08792-1). المحل في -20 درجة مئوية. 5. ممثل النتائج الشكل 2. تم حقن صبغة موضع محبة للدهون والتصوير في جنين الفأر ثلاثة أصباغ مختلفة الطول الموجي محبة للدهون والمحتضنة للسماح التصور من العصب الثلاثي التوائم (تينيسي) ، عصب (GN) ، والعصب المبهم (VN) إسقاطات المركزية. أ) موضع محبة للدهون في صبغ الأجزاء الطرفية من ثلاثة الأعصاب القحفية للسماح للنشر في الدماغ عن تصور عملياتها المركزية. هو المسمى TN مع الأحمر NeuroVue ، GN : المارون NeurVue وVN : NeuroVue اليشم. B) الماوس في نفس الحضانة بعد (A). ويمكن رؤية بعض نشرها مع brightfield المجهري. C) الفأر نفسه كما في (A و B). وقد تم تشريح الدماغ المؤخر وشنت المسطحة. ويمكن ملاحظة بعض العلامات من العمليات المركزية للأعصاب three المسمى مع brightfield المجهري. د) صورة من متحد البؤر (C). مع ويمكن ملاحظة استخدام الخلايا العصبية المحددة مبائر ، واستخدام ثلاثة ألوان مختلفة يسمح لتقييم توزيع السكان في كل ما يتعلق الآخرين. وقد التقط الأصباغ بشكل تسلسلي. تم تصوير NeuroVue اليشم في جامعة النجاح الإثارة من 488 نانومتر ، والانبعاثات 500-550 نانومتر. تم تصوير NeuroVue الاحمر فى استثارة 535 نانومتر وانبعاث 550-600 نانومتر. تم تصوير NeuroVue المارون في جامعة النجاح الإثارة من 643 نانومتر ، والانبعاثات على 650-700 نانومتر. الشكل 3 نظرة عامة رسم تخطيطي للتجربة. تتعرض الأذن للسماح لرؤية جميع الهياكل. صبغ هو محبة للدهونثم حقن وسمح لنزع فتيل. ويمكن أن ينظر إليه بعد نشر السكان العصبية المسماة متميزة من الأصباغ المختلفة. المقبل ، في الموقع التهجين (sox2) يتم تنفيذها على الأذن والتسميات التعبير مرنا. ويتم بعد ذلك الخروج المناعية (Myo7 ، تويولين) لتصور بروتين تعبير. تليها قطاعات النسيجية والتي على حد سواء في الموقع التهجين والمناعية يمكن تصور.
Discussion
في هذا الفيديو ، ونحن يبرهن على وجود طريقة لدمج أربع تقنيات من أجل تحقيق أقصى قدر من التماسك وجمع البيانات عن طريق الربط بين البيانات داخل حيوان معين (الشكل 3). هذا النهج سوف تقلل من كمية تربية ، وبالتالي الوقت اللازم للحصول على بيانات للنشر وتحسين المعلومات حول توطين المشترك والآثار المترابطة من المسوخ. وعلى الرغم من واستخدمت الفئران الجنينية في هذه الفأرة والفيديو الكبار وكذلك الحيوانات الأخرى مثل الدجاج ، والضفدع ، والزرد يتم تحليلها باستخدام هذه التقنيات كذلك. عند استخدام أنواع أخرى قد بروتيناز ك الهضم تحتاج إلى تغييرها. هنا نستخدم الأصباغ المختلفة NeuroVue الاستشعاع لتسمية تحديدا ما يصل إلى ثلاثة من السكان العصبية الفائدة. الاستفادة من هذه الأصباغ هي التي يمكن استخدامها في فئرانا معدلة وراثيا ، والتي قد تكون مشكلة عند الاعتماد فقط على المناعية التي قد تكون أو لا تكون المتضررة من الطفرات التي سيتم تحليلها ، وأنها تسمية الخلايا العصبية وretrogradely anterogradely 5. وزاد أيضا دراسة حديثة أن عدد السكان الخلايا العصبية التي يمكن أن توصف في وقت واحد الى ستة 2. بعد ذلك ، ثم صباغة النسيج محبة للدهون تتبع نفس الفائدة يتم تحليلها باستخدام التهجين في الموقع ، لتحليل الجينات والاستنساخ ويمكن تحليلها في وقت لاحق باستخدام المناعية للتوزيع البروتين. ويمكن استكمال التحليل الأخير الأنسجة التفصيلية التي يمكن أن تضاف إلى توصيف النمط الظاهري 6. هذا التحليل متعدد العوامل لديه القدرة على اكتساب رؤى جديدة من خلال تحليل المتلازم ضمن نفس الحيوان التي يمكن أن يكون الأمر خلاف ذلك واردا ، أو على الأقل في حاجة إلى مزيد من البروتوكولات واسعة وخصبة الماوس.
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم الحصول على الصور مبائر في جامعة ولاية ايوا كارفر مركز التصوير. وقدمت وقدمت التمويل عن طريق منح SBIR (MH079805) لدعم BF إضافية لتربية الفئران لهذا المشروع من قبل NIDCD (5R01DC00559007) لBF
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| in situ Hybridization: | ||||
| PC DIG wash + block buffer set | Roche | 1585762 | ||
| Premix 20x SSC Buffer | Roche | 1666681 | ||
| Proteinase K 20mg/ml | Ambion | AM2546 | ||
| Diethyl Pyrocorbonate (DEPC) | RPI | D43060 | ||
| Formamide | Sigma | F9037 | ||
| Dextran Sulfate | RPI | D20020 | ||
| BM Purple | Roche | 11442074001 | ||
| Anti-Dig-AP Fab fragments | Roche | 11093274910 | ||
| RNase A enzyme 10mg/ml | Fermentas | EN0531 | ||
| RNase Away | RPI | 7003 | ||
| Salmon Sperm DNA 10mg/ml | Invitrogen | 15632-011 | ||
| Stericup Filter Unit 0.22μm; 500ml | Millipore | SCGVU05RE | ||
| Filter Discs 0.2μm; 25mm | Whatman | 6780-2502 | ||
| Phosphate buffered saline PH 7.4 packets | Sigma | P-5368 | ||
| Immunohistochemistry: | ||||
| Goat Serum | Sigma | G9023 | ||
| Triton X-100 | Sigma | T8532 | ||
| Hoechst Dye | Polysciences Inc. | 9460 | ||
| Histology: | ||||
| Poly/Bed 812 Embedding Media/DMP-30 Kit | Polysciences Inc. | 08792-1 | ||
| Propylene oxide | Sigma | 110205 | ||
| Gluteraldehyde Solution 50% | Fisher | G151 | ||
| DPX Mountant | Fluka | 44581 | ||
| Rocker | MidSci | 55D1114 | ||
| Heat Block | Fisher | 11-715-125D | ||
| Rotator | Thermo | 400110Q | ||
| Incubator set to 60° | Fisher | 11-690-625D | ||
| Dye tracing: | ||||
| Microscissors | Geuder | G-19775 | ||
| Fine Forceps | E.M.S | 72680-F | ||
| NeuroVue dye: Maroon, Red, Jade | MTTI | FS-100(1,2,6) | ||
| 1X phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | P-5368 | ||
| Dissecting scope | Leica | M205 FA | ||
| Incubator set to 36° | Fisher | 11-690-506DQ | ||
| Confocal Microscope | Leica | LSM 510 | ||
| Slides | Surgipath | 00240 | ||
| Coverslips | Surgipath | 00106 | ||
| RPI | Glycerol | G22025-0.5 | ||
| Paraformaldehyde (4% and 0.4%) | Fisher | T353-500 |
Referencias
- Jensen-Smith, H., Gray, B., Muirhead, K., Ohlsson-Wilhelm, B., Fritzsch, B. Long-distance three-color neuronal tracing in fixed tissue using NeuroVue dyes. Immunol Invest. 36, 763-789 (2007).
- Tonniges, J. Photo- and bio-physical characterization of novel violet and near-infrared lipophilic fluorophores for neuronal tracing. Journal of Microscopy. , (2010).
- Bartheld, C. S. v. o. n., Cunningham, D. E., Rubel, E. W. Neuronal tracing with DiI: decalcification, cryosectioning, and photoconversion for light and electron microscopic analysis. J Histochem Cytochem. 38, 725-733 (1990).
- Gurung, B., Fritzsch, B. Time course of embryonic midbrain thalamic and thalamic auditory connection development in mice as revealed by carbocyannine dye injection. J Comp Neurol. 479, 309-327 (2004).
- Fritzsch, B., Nichols, D. H. DiI reveals a prenatal arrival of efferents at the differentiating otocyst of mice. Hear Res. 65, 51-60 (1993).
- Jahan, I., Kersigo, J., Pan, N., Fritzsch, B. Neurod1 suppresses hair cell differentiation in ear ganglia and regulates hair cell subtype development in the cochlea. PloS ONE. 5, e11661-e11661 (2010).
Tags
Lipophilic DyeIn Situ HybridizationImmunohistochemistryHistologyGene Regulatory NetworksMultiple MutationsWhole Mounted Developing OrgansCellular Expression AlterationsCre Or FlipaseConditional Gene DeletionBreeding SchemesGenetic ModificationsExpression ProfilesHistologically Recognizable StructuresGene And Protein Expression
Citar este artículo
Duncan, J., Kersigo, J., Gray, B., Fritzsch, B. Combining Lipophilic dye, in situ Hybridization, Immunohistochemistry, and Histology. J. Vis. Exp. (49), e2451, doi:10.3791/2451 (2011).