Dev Fiber Pathway Elektrofizyolojik Kayıtlar D. melanogaster</em

1. Ekipman ve Malzeme Bu deneyler, bir uyarıcıdır bir uyarıcı izolasyon ünitesi, iki mikroelektrot amplifikatörler, bir veri toplama sistemi ve toplama bir bilgisayar yazılımı ile oluşan bir standart elektrofizyoloji kurulum kullanın. Ek donanım, Faraday kafesi, bir patlama standında bir stereomikroskopta, bir titreşim izolasyonu tablo, bir ışık kaynağı ve bir kayıt platformu içerir. Beş mikromanipülatörler kullanılır. İki mikromanipülatörler, diğer üç mikromanipülatörler sadece iki uyarımı elektrot ve toprak elektrot yerleştirmek için brüt kontrolleri gerektirir kayıt elektrotları konumlandırma için ince kontrolleri gerektirir. DLM kayıt elektrodu için mikromanipülatör hazırlık sonunda kuyruk yerleştirilir (deneyci sol) ve TTM kayıt elektrodu için mikromanipülatör hazırlık deneyci ve yan (biraz deneyci sol) arasına yerleştirilir. Simülasyon elektrotlar yapacak iki mikromanipülatörler hazırlık başkanı (sağ deneyci) yerleştirilir. Toprak elektrot için mikromanipülatör hazırlık uzak tarafında yer alır M 40-60 dirençler cam kayıt Mikroelektronlar çekin ve balmumu tarafından desteklenen bir tabak içinde düz olarak saklayın. Stimülasyonu için, elektrolitik (NaOH) bilenmiş iki tungsten elektrot kullanılır. Bir tungsten tel, ya da üçüncü bir elektrolitik fabrikasyon elektrot bir zemin olarak kullanılır. Uyarıcı ve toprak elektrotları ve mikromanipülatörler bağlı hazırlanan deneysel oturumu başlamadan önce oturumun süresi için değiştirilmesi gerekmez. 2. D. Hazırlama melanogaster Donatım ayarlandıktan sonra, sineklerin hazırlamak için zaman. Buz soğutma veya CO 2 ile sinek anestezisi. CO 2 kullanılması durumunda, daha sonra gaz etkilerini deney başlamadan önce eskitmek için yeterli zaman (20mins hakkında) izin. Forseps, yaklaşık 45 ° açıyla eğimli yumuşak balmumu bir platform içeren bir çanak bacaklarını hafifçe sineklerin aktarmak için kullanın. (Ama yakın) kayıt cihazları önümüzdeki dört adım uzakta bir diseksiyon mikroskop altında yapılır. Bir sonraki adım, balmumu sinek güvence altına alınmasıdır. Yamacında ön bakan yukarı aşağı Orient sinek ventral tarafında. Bir çift güzel forseps kullanarak, çift, bacaklar dışa doğru genişletmek ve balmumu içine itmek. Dorsal longitudinal kas, ya da DLM, ve tergotrochanteral kas, veya TTM: kaydedilecek kaslar yer hakkında bilgi edinin. DLMS subkütiküler eki siteleri göğüs orta hat ve anterior dorsal kıllar (ya da setanın) arasındaki bölge ile karşılık gelir. TTM ek siteler arka ve ön supra-alar kıllar dorsal bulunmaktadır. Kanatları, DSB veya TTM lifleri erişim engel kanatları dışa doğru tutun ve 'yapıştırıcı' balmumu olmaz ki emin olun. Güzel bir çift forseps kullanarak, burnumun dışa dikkatle çekin ve güvenli balmumu içine çeker. Bu, probosis yumuşak ve kolay baş geri kalanından kopuk olduğundan biraz pratik gerektiren bir kritik bir adımdır. Eğer bu gerçekleşirse, sinek atmak ve baştan başlayın. Gözüyle uyarıcı elektrotlar takarken bu şekilde baş güvenli takdirde sorunlara yol açar. 3. Elektrotlar yerleştirilmesi Sinek balmumu demirlemiş sonra, Faraday kafesi içinde bulunan stereomikroskop altında ekli sinek çanak aktarın. Orient yana uçan sinek deneyci sağ kafa ile. Bir sonraki adım, elektrotlar eklemek için. Zemin ve uyarıcı elektrotlar mikroskop ile bakmadan eklenebilir. İyi kayıtları kesin Impalement güveniyor, mikromanipülatörler işleme uygulamaya iyi bir fikirdir. Elektrotlar yardımı ile uygun yerleştirilmesi ve sonraki kayıtları kolaylaştırmak için mikromanipülatörler ekleme siteleri yakın getirin. Mikromanipülatör ayar çarkları kullanarak karın arka ucunu toprak elektrot indirin. Beyindeki bilenmiş tungsten uyarıcı elektrotlar yerleştirmek için, sadece bir sineğin gözleri dokunur, böylece bir elektrot ucu konumuna mikromanipülatör kullanın. Diğer iki elektrot sadece her bir gözün dış dokunmadan bu nedenle de aynı işlemi yapın. Sonra elektrotlar itmek, sırayla, her bir göz ile baş kapsülü (yaklaşık 2-3mm) arkasında yer alan elektrot uçları beyne ulaşmasına. Doğru yerleştirilen elektrotlar Dev Fiber sistemi aktive eder. Uyarıcı elektrotlar doğru yerleştirildiğinden olduğunu test etmek için, 30-60 (0.03 ms) kısa bir uyarıcıyı uygulamayaV uyarıcı elektrotlar, kanat ve uçuş / bacak kas seyirmesi hareketi göz arasında ' Bir sonraki adım, Hamilton veya ısı çekti plastik şırınga kullanarak 3M KCl ile cam Mikroelektronlar geri dolgu ve ince kontrol mikromanipülatörler içine yerleştirin. Düzgün yerleştirildiğini Mikroelektronlar deneyler birkaç tur için kullanılabilir. Ilk kayıt elektrodu DLM lif eklenecektir. Bilateral simetrik iki DLMS vardır; her biri altı ayrı kas lifleri oluşmaktadır. Altı lifleri herhangi kayıtları yapılır, ancak en sık kullanılan DLM lifleri torasik manikür dorsal tarafında yoluyla iyi erişilebilirlik nedeniyle 45a ve 45b ve aynı motorneuron hem lifleri innerve olduğu gerçeği . En uzak tarafında mikromanipülatör kullanarak, DLM fiber 45a veya b. bir kayıt elektrodu eklemek Platformunun eğimi DLM elektrot penetrasyon yardımcıları ~ 60-90 ° açı, dorsal manikür girmek için izin verir. Osiloskop modunda yazılımı kullanın ve göğüs kafesi içine kayıt elektrotları eklerken bilgisayar monitörü bakmak. Temel elektrot bir kas girdiğinde yakın sıfır veya negatif bir değere düşecektir. Kas yanıtı gözlemlemek olmadığını görmek için tek bir uyaran ile test. Size en yakın TTM diğer kayıt elektrodu takın. Bu elektrot, önünüzde kas eki sitenin konumu nedeniyle, yanal eklenir. Yine monitör izleme elektrot kas olduğunu gösterir bu kez tek bir uyarıcı ve test yaparken gözlemliyoruz. 4. Uyarılma ve Kayıt Artık beyin ve kayıt yanıtları bacak ve uçuş kasları uyarıcı başlamak için hazırız. (Bilgisayar monitörü görüldüğü gibi, yani bir kas seğirme ve kas hücre depolarizasyon) bir yanıt gözlemlemek kadar 30 V ve 60 V artan uyarıcı elektrotlar arasında kısa bir uyaran (0.03 ms) uygulayın. Deney kalanı için, yanıt eşiğinin üzerinde gerilim 5-10 V ayarlayın. Cevap gecikmesi ölçmek için, her bir uyaran arasında 5 saniyelik bir dinlenme süresi en az 5 tek uyaranlara verir. Farklı hızlarda uyaranların trenler "aşağıdaki frekans" belirleyin. Genellikle 10 trenler 10 uyaranlara 200Hz (her uyaran arasındaki 5ms) ve 300Hz (3ms arasında her uyaran) 100Hz (her uyaran arasındaki 10ms) verilmiştir. Uyaranların her tren arasında 2 saniyelik bir dinlenme süresi izin verin. 5. Sonuçlar: Dev Fiber Pathway ardından Tepkisi Gecikme ve Frekans Yanıt gecikme beyin uyarımı ve kas depolarizasyon arasındaki zaman. Bu rakam tek bir uyarana yanıt latans DLM ve TTM karşılaştırır. Gecikme, 0.7 ve 1.2 ms GF-TTM yolun ve GF-DLM yol için 1.3 ve 1.7 ms arasında arasında sağlıklı bir hazırlık ve uygun kayıt tekniği göstermektedir. Gecikmeleri genotip, genetik arka plan, sıcaklık ve yaşa göre değişir. Şekil 1 (A ve B). Temsilcisi beyne uygulanan tek bir uyarıcı TTMs ve DLMS kaydedilen tepkiler gösteren izler. Burada gösterildiği gibi, TTM kayıtları genlik ve büyük DLM liflerinden göre postsinaptik potansiyel (PSP) şekil açısından daha fazla değişkenlik göstermektedir; bu artan değişkenlik TTM kas lifleri küçük boyutu nedeniyle. Ancak, bu değişkenliği, Dev Fiber-to-TTM yolun yanıt latans değerleri etkiler değildir. Şekil 1 (C ve D) daha fazla 'tepki gecikme' TTM ve DLM hem de 4 ayrı sinekler izler. Not PSP şeklinde TTM izleri sergi değişkenlik ama cevap gecikmesi etkilenmez. DLM için PSP şekli daha az değişkenlik yoktur. Her stimülasyon frekansta DLM ve TTM yollar hem de başarılı yanıtlar (10) oranı hesaplanarak, 100 Hz, 200 Hz ve 300 Hz "aşağıdaki frekans" karşılaştırın. 100 Hz, hem TTM ve DLM uyaranlara 01:01 izleyin. Iki internöronlar arasında aracılık kimyasal sinaps uyaranlar arasında kurtarmak için yeterli zaman olmadığı için, yukarıda stimülasyon frekansları 100 Hz DLM yanıtları hataları göstermeye başlar. TTM tepkiler, ancak, 1:1 300Hz ötesinde bile uyaranlara kalır. Şekil 2 "aşağıdaki frekans" kayıtları gösteren Temsilcisi izleri. 100Hz, her iki TTMs ve DLMS Tüm 10 (solda) uyaranlara yanıt verir. 200Hz, DLM yanıtlar (yıldız) başarısız başlar. 6. Temsilcisi Sonuçlar Vahşi tip kısa gecikmeli yanıtlar (uyarılan elektrotlar duyu reseptörleri atlayarak doğrudan GF devre tetikleme, gözler yerleştirilir) GF-TTM yol için 0.7 ve 1.2 ms arasında genotip, genetik arka plan, sıcaklık ve yaş ve aralık bağlıdır and1.7 GF-DLM yolak 1.3 ms (Tanouye ve Wyman, 1980; Thomas ve Wyman, 1984; Engel ve Wu, 1992; Allen ve Murphey, 2007; Phelan ve ark, 2008; Augustin ve ark, yayınlanmamış.) . Bu çok kısa TTM gecikme monosinaptik yol ve uzun DLM gecikme sağlam GF-TTMN elektrokimyasal sinaps nedeniyle yolun disynaptic doğanın yanı sıra bir kimyasal sinaps (PSI DLMn) varlığı nedeniyle oluşur. Orta ve uzun gecikmeli tepkiler GF afferentlerin aktivasyonu ve daha düşük bir yoğunluğu stimülasyon kullanarak ya da görsel ("ışık-off") sinyal sağlayarak elde edilir (> 3 ms) sonucu. 100Hz TTM ve DLM uyaranlara 01:01 takip etmelidir. 100Hz şeyden DLM yanıtları PSI ve DLMns arasındaki kimyasal sinaps dışında 10ms az uyaranlara arasında kurtarmak için yeterli zamana sahip değildir hatalarını göstermeye başlayacaktır. Ancak, TTM tepkiler bile 300Hz (Engel ve Wu, 1992; Allen ve ark, 2007; Martinez ve ark, 2007 Tanouye ve Wyman, 1980) ötesinde uyaranlara 1:1 kalacaktır. GF-DLM şube tepkisiz bir Drosophila gap junction kanal kodlama ("innexin") shakB genindeki mutasyonlar, GF-TTM yolak (~ 1.5 ms) tepki gecikme önemli ölçüde artış (Allen ve Murphey, 2007; Phelan ve ark, 2008). Mutant yanıt kesintiye nöromüsküler iletim nedeniyle gecikmeli etkisi olduğunu gösteren, torasik ganglionlar doğrudan uyararak restore edilebilir. Yüksek frekanslı stimülasyon takip yeteneği de vahşi tip GF-DLM ve GF-TTM yollar genellikle sırasıyla 100 Hz ve 300 Hz, 1:1 oranına sahip 10 uyaranlara takip edebiliyoruz uçar göre bu mutant bozulur. Bu frekansları sözleşme kasları sürekli uçuş (3-10 Hz) (Hummon ve Costello, 1989) sırasında alınan normal stimülasyon frekansları oldukça üstünde olduğunu not etmek önemlidir. GFS çıkışları istikrarı tanımlamak için kullanılan bir başka parametre "refrakter dönem", ya da hala kas iki cevap üretir ikiz uyaran bakliyat arasındaki minimum süre. Refrakter TTMs ve DLMS için 7-15 ms ms 1-4 arasında değişir. DLMS için nispeten uzun bir refrakter dönem nispeten PSI DLMn kavşağı (Tanouye ve Wyman, 1980 kimyasal sinaps labil nedeniyle; Gorczyca ve Hall, 1984; Engel ve Wu, 1992; Banerjee ve ark, 2004; Allen ve Godenschwege 2010).