Enregistrements électrophysiologiques de la voie des fibres Géant de D. melanogaster</em

1. Équipement et matériel Ces expériences utilisent une configuration standard électrophysiologie composé d'un stimulateur, une unité d'isolement de relance, deux amplificateurs microélectrode, un système d'acquisition de données et un ordinateur avec un logiciel de collecte. L'équipement supplémentaire comprend une cage de Faraday, un stéréomicroscope sur une perche, une table anti-vibrations, une source de lumière, et une plateforme d'enregistrement. Cinq micromanipulateurs sont utilisés. Deux micromanipulateurs exigent des contrôles très bien pour le positionnement des électrodes d'enregistrement, tandis que les trois autres micromanipulateurs seulement exigent des contrôles brute à la position des deux électrodes de stimulation et l'électrode de masse. Le micromanipulateur pour l'électrode d'enregistrement DLM est placé à la toute fin de la préparation (à gauche de l'expérimentateur) et le micromanipulateur pour l'électrode d'enregistrement TTM est placée entre l'expérimentateur et le côté de la préparation (légèrement à gauche de l'expérimentateur). Les deux micromanipulateurs qui contiendra les électrodes de simulation sont placés à la tête de la préparation (à droite de l'expérimentateur). Le micromanipulateur pour l'électrode de masse est placé à l'extrémité de la préparation Tirez microélectrodes d'enregistrement en verre avec des résistances de 40-60 MQ et stocker à plat dans un plat soutenu par la cire. Pour la stimulation, deux électrodes de tungstène par électrolyse (NaOH) aiguisés sont utilisés. Un fil de tungstène, ou une troisième électrode électrolyse fabriquée est utilisée comme un motif. Les électrodes de stimulation et la terre sont préparés et attachés à la micromanipulateurs avant le début de la session expérimentale et ne doit pas être remplacé pour la durée de la session. 2. Préparation de la D. melanogaster Une fois que votre équipement est mis en place, il est temps de préparer les mouches. Anesthésier les mouches par le refroidissement de la glace sur eux ou en utilisant du CO 2. Si le CO 2 est utilisé, puis laisser suffisamment de temps (environ 20mn) pour les effets des gaz à s'user avant le début de l'expérience. Utilisez une pince pour transférer les mouches doucement par leurs jambes pour un plat contenant une plate-forme de cire molle incliné à un angle de 45 ° environ. Les quatre prochaines étapes sont effectuées sous un microscope à dissection loin (mais proche de) l'équipement d'enregistrement. La prochaine étape est de sécuriser la volée dans la cire. Orienter le côté voler ventrale vers le bas, avec ses antérieure orientée vers le haut sur la pente. En utilisant une paire de pinces fines, étendre les jambes vers l'extérieur, par paires, et les pousser dans la cire. Familiarisez-vous avec l'emplacement des muscles pour être enregistrées à partir de: le muscle dorsal longitudinal ou DLM, et le muscle tergotrochanteral ou TTM. Les sites de fixation de l'subcuticulaires DLMS correspondre à la région située entre la ligne médiane thoracique et de la dorsale antérieure poils (ou soies). Les sites de fixation sont situés dorsalement TTM de l'antérieur et postérieur supra-alaires poils. Faire en sorte que les ailes ne seront pas gêner l'accès aux fibres DLM ou TTM, maintenez les ailes vers l'extérieur et «coller» à la cire. Utiliser une belle paire de pinces, tirez la trompe vers l'extérieur avec soin, et fixez-le en l'immergeant dans la cire. Ceci est une étape critique qui nécessite une certaine pratique depuis la trompe est souple et se détache facilement du reste de la tête. Si cela arrive, jetez la volée et recommencer. Faute d'obtenir la tête de cette manière conduit à des problèmes lors de l'insertion des électrodes de stimulation par les yeux. 3. Placement des électrodes Une fois que la mouche est ancré à la cire, le transfert du plat avec la mouche fixé sous le stéréomicroscope qui est situé à l'intérieur de la cage de Faraday. Orienter la volée sur le côté avec la tête de la mouche à la droite de l'expérimentateur. L'étape suivante consiste à insérer les électrodes. Électrodes de masse et la stimulation peut être inséré sans regarder dans le microscope. De bons enregistrements comptent sur empalement précis, c'est donc une bonne idée de pratiquer la manipulation des micromanipulateurs. Apportez les électrodes à proximité des sites d'insertion avec l'aide de micromanipulateurs afin de faciliter leur placement judicieux et des enregistrements ultérieurs. L'électrode de masse inférieure à l'extrémité postérieure de l'abdomen en utilisant les roues de réglage sur le micromanipulateur. Pour placer les électrodes de tungstène affûté stimulant dans le cerveau, l'utilisation du micromanipulateur pour positionner la pointe de l'une des électrodes de sorte qu'il touche juste l'un des yeux de mouche. Faites de même avec l'autre afin que les deux électrodes sont juste toucher l'extérieur de chaque oeil. Ensuite, poussez les électrodes, à leur tour, à travers chaque œil de sorte que le bout des électrodes atteindre le cerveau située à l'arrière de la capsule céphalique (environ 2-3mm). Électrodes placées correctement pour activer le système de fibre géante. Pour vérifier que les électrodes de stimulation sont placés correctement, appliquer une courte (0,03 ms) Relance de 30-60 V sur les électrodes de stimulation, et regarder pour le mouvement des ailes et des tics du muscle vol / jambe » L'étape suivante consiste à remblayer les microélectrodes en verre avec 3M KCl en utilisant un Hamilton ou à la chaleur tirée seringue en plastique et les placer dans le micromanipulateurs beaux-contrôle. Microélectrodes insérées correctement peuvent être utilisés pour plusieurs séries d'expériences. L'électrode premier enregistrement sera inséré dans une fibre DLM. Il ya deux DLMS bilatéralement symétriques, chacune est composée de six fibres musculaires individuelles. Les enregistrements peuvent être fait à partir de n'importe laquelle des six fibres; cependant, les plus couramment utilisés sont les fibres de DLM 45a et 45b en raison de leur bonne accessibilité grâce à la face dorsale de la cuticule thoracique, et le fait que les deux fibres sont innervées par les motoneurones mêmes . Utilisation du micromanipulateur sur le côté le plus éloigné de vous, insérez une électrode d'enregistrement en fibre de DLM 45a ou b. La pente de la plate-forme permet à l'électrode DLM pour entrer dans la cuticule dorsale à un angle de ~ 60 à 90 °, ce qui favorise la pénétration. Utilisez le logiciel en mode oscilloscope et de regarder l'écran d'ordinateur tout en insérant des électrodes d'enregistrement dans le thorax. Lorsque l'électrode est entré dans un muscle de la ligne de base passera à près de zéro ou une valeur négative. Test avec un stimulus unique de voir si vous pouvez observer la réponse musculaire. Insérer l'électrode d'enregistrement autre dans le TTM proche de chez vous. Cette électrode est insérée latéralement, en face de vous, à cause de l'emplacement du site d'attachement du muscle. Encore une fois d'observer le moniteur tout en faisant cela et de tester avec un stimulus unique fois la trace indique l'électrode est dans le muscle. 4. Stimulation et d'enregistrement Vous êtes maintenant prêt à commencer la stimulation du cerveau et de l'enregistrement des réponses de la jambe et les muscles de vol. Appliquer une courte (0,03 ms) relance à travers les électrodes de stimulation à partir de 30 V et 60 V augmente jusqu'à ce que vous observez une réaction (à savoir une contraction musculaire, et une dépolarisation des cellules musculaires comme observé sur l'écran d'ordinateur). Pour le reste de l'expérience, régler la tension V 50-10 dessus du seuil de réponse. Pour mesurer la latence de réponse, donnez au moins 5 des stimuli simples avec une durée de 5 secondes de repos entre chaque stimulus. Déterminer la "fréquence de suivre" en fournissant des trains de stimuli à des rythmes différents. Typiquement 10 trains de 10 stimuli sont donnés à 100Hz (10ms entre chaque stimulus), 200Hz (5ms entre chaque stimulus) et 300Hz (3ms entre chaque stimulus). Autoriser une période de repos de 2 secondes entre chaque train de stimuli. 5. Résultats: latences de réponse et fréquence de la suite dans la voie des fibres géantes La latence de réponse est le temps entre la stimulation du cerveau et de la dépolarisation du muscle. Ce chiffre se compare les latences de réponse pour DLM et TTM à un stimulus unique. Latences entre 0,7 et 1,2 ms pour la voie de GF-TTM et entre 1,3 et 1,7 ms pour la voie de GF-DLM indiquent une préparation saine et technique d'enregistrement approprié. Les latences peuvent varier avec le génotype, le patrimoine génétique, de la température et l'âge. La figure 1 (A et B). Représentant des traces montrant les réponses enregistrées à partir du TTMS et DLMS suite à un stimulus unique appliquée au cerveau. Comme le montre ici, les enregistrements de la TTM montrent plus de variabilité en termes d'amplitude et la forme des potentiels postsynaptiques (PSP) comparativement à ceux des fibres DLM grande; cette variabilité accrue est due à la faible taille des fibres musculaires TTM. Cette variabilité, cependant, n'affecte pas les valeurs de latence de réponse pour le géant de fibre-to-TTM voie. «Latence de réponse» La figure 1 (C et D). En outre des traces de 4 mouches individuels à la fois pour la TTM et DLM. Notez la variabilité présentent des traces en forme de TTM PSP mais la latence de réponse n'est pas affectée. Pour DLM il ya moins de variabilité dans la forme PSP. Comparez la «fréquence de suivre" à 100 Hz, 200 Hz, 300 Hz et en calculant la proportion de réponses réussies (sur 10) pour les deux voies de DLM et TTM à chaque fréquence de stimulation. A 100 Hz, les deux TTM et DLM suivre les stimuli 01h01. Au fréquences de stimulation supérieures à 100 Hz, les réponses DLM commencer à montrer des défaillances en raison de la synapse chimique intermédiaire entre deux interneurones n'a pas suffisamment de temps pour récupérer entre les stimuli. Les réponses TTM, cependant, restent 1:1 avec des stimuli au-delà même 300Hz. Figure 2. Représentant des traces montrant la "fréquence de la suite" des enregistrements. A 100Hz, deux TTMS et DLMS répondre à toutes les 10 stimuli (à gauche). A 200 Hz, les réponses commencent à échouer DLM (astérisque). 6. Les résultats représentatifs Sauvage de type court temps de latence des réponses (électrodes stimulés sont placés dans les yeux, sans passer par les récepteurs sensoriels et de déclencher le circuit GF directement) dépendent du génotype, le patrimoine génétique, la température et l'âge, et se situent entre 0,7 et 1,2 ms pour la voie de GF-TTM et 1,3 ms pour and1.7 la voie GF-DLM (Tanouye et Wyman, 1980; Thomas et Wyman, 1984; Engel et Wu, 1992; Allen et Murphey, 2007; Phelan et al, 2008;. Augustin et al, non publié.) . Cette latence très court TTM est dû à la robustesse des synapses GF-TTMn électrochimique de la voie monosynaptique et la latence plus DLM se produit parce que la nature disynaptique de la voie ainsi que la présence d'une synapse chimique (PSI-DLMn). Intermédiaire et à long temps de latence des réponses (> 3 ms) résultent de l'activation des afférences GF et sont réalisés soit en utilisant une stimulation de faible intensité ou de fournir un visuel («light-off») du signal. À la fois 100Hz TTM et DLM devrait suivre les stimuli 01h01. Au-dessus de 100Hz réponses DLM va commencer à montrer des défaillances que la synapse chimique entre l'ISP et le DLMns n'a pas suffisamment de temps pour récupérer entre les stimuli moins de 10ms d'intervalle. Réponses TTM, toutefois, restera à 1:1 avec des stimuli au-delà même 300Hz (Tanouye et Wyman, 1980; Engel et Wu, 1992;. Allen et al, 2007;. Martinez et al, 2007). Des mutations dans le gène shakB, codant pour une drosophile écart de jonction canal ("innexin"), augmenter considérablement la latence de réponse de la voie de GF-TTM (~ 1,5 ms) tandis que la branche GF-DLM est insensible (Allen et Murphey, 2007; Phelan et al., 2008). La réponse mutant peut être restauré par la stimulation directe ganglions thoraciques, démontrant que l'effet retard n'est pas dû à la transmission neuromusculaire perturbé. La capacité à suivre une stimulation à haute fréquence est également altérée chez ces mutants par rapport au type sauvage mouches, où les voies de GF-DLM et GF-TTM sont généralement en mesure de suivre 10 stimuli avec un rapport de 1:1 jusqu'à 100 Hz et 300 Hz, respectivement. Il est important de noter que ces fréquences sont nettement au-dessus des fréquences de stimulation normale perçue par les muscles contracter pendant le vol soutenue (3-10 Hz) (Hummon et Costello, 1989). Un autre paramètre utilisé pour décrire la stabilité des sorties GFS est la «période réfractaire», ou le temps minimal entre les impulsions de stimulation jumeaux qui produit encore deux réponses du muscle. Le temps varie entre 1-4 réfractaires ms pour TTMS et 7-15 ms pour DLMS. La période relativement longue pour les réfractaires DLMS est due à relativement labile synapses chimiques, à la jonction PSI-DLMn (Tanouye et Wyman, 1980; Gorczyca et Hall, 1984; Engel et Wu, 1992; Banerjee et al, 2004;. Allen et Godenschwege, 2010).