Recombinante de producción retrovirales y la infección de células B
Summary
Un sistema eficiente de la estructura y análisis de la función de un gen en un<em> Ex vivo</em> Cultura de los linfocitos B del bazo se describe. Este método tiene la ventaja de la producción recombinante de antirretrovirales en una línea gratuita de ayuda, ecotrófica celular de empaquetamiento. Estables, heredables expresión de un gen de interés dentro de los linfocitos primarios se logra llevando a la generación de anticuerpos de superficie de las células B sometidos a la recombinación de cambio de clase.
Abstract
La expresión transgénica de genes en células eucariotas, es un poderoso método de genética inversa en la que se expresa un gen de interés bajo el control de un sistema de expresión heteróloga para facilitar el análisis del fenotipo resultante. Este enfoque puede ser usado para expresar un gen que no se encuentra normalmente en el organismo, para expresar una forma mutante de un gen producto, o sobre-expresa una forma dominante negativa del producto del gen. Es particularmente útil en el estudio del sistema hematopoyético, que la regulación transcripcional es un mecanismo de control importante en el desarrollo y diferenciación de células B 1, revisada en 02.04.
La genética del ratón es una herramienta poderosa para el estudio de los genes y las enfermedades. Un análisis comparativo con el ratón y el genoma humano revela la conservación de synteny en más del 90% del genoma 5. Además, gran parte de la tecnología utilizada en modelos de ratón es aplicable al estudio de los genes humanos, por ejemplo, alteraciones de genes y la sustitución alélica 6 . Sin embargo, la creación de un ratón transgénico que requiere una gran cantidad de recursos tanto de carácter financiero y técnico. Varios proyectos han comenzado a compilar las bibliotecas de eliminar cepas de ratón (KOMP, EUCOMM, NorCOMM) o mutagénesis inducida por las cepas (RIKEN), que requieren grandes esfuerzos y la colaboración 7. Por lo tanto, es deseable que el primer estudio del fenotipo de un gen deseado en un modelo de cultivo celular de células primarias antes de pasar a un modelo de ratón.
ADN retroviral se integra en el ADN del huésped, de preferencia dentro de o cerca de las unidades de transcripción o de las islas CpG, lo estable y heredable expresión del gen de empaquetado de interés y evitar el silenciamiento transcripcional 8 9. Los genes se transcriben bajo el control de un promotor de la eficiencia retroviral de alta, resultando en una alta eficiencia de la transcripción y la producción de proteínas. Por lo tanto, la expresión retroviral se puede utilizar con las células que son difíciles de transfectar, siempre y cuando las células están en un estado activo durante la mitosis. Debido a que los genes estructurales del virus se encuentran dentro de la línea celular de empaquetamiento, los vectores de expresión que se usa para clonar el gen de interés no contienen genes estructurales del virus, que no sólo elimina la posibilidad de reversiones viral y aumenta la seguridad de trabajar con los sobrenadantes virales como no viriones infecciosos se producen 10.
Aquí se presenta un protocolo para la producción recombinante de retrovirales y la posterior infección de las células B del bazo. Tras el aislamiento, las células del bazo cultivadas son estimulados con linfocinas Th derivados y anti-CD40, lo que induce a una explosión de la proliferación de células B y diferenciación 11. Este protocolo es ideal para el estudio de los acontecimientos que se presentan en el desarrollo de células B y la diferenciación, las células B están aislados del bazo tras los primeros eventos hematopoyéticas, pero antes de la estimulación antigénica para inducir la diferenciación plasmáticas.
Protocol
Discussion
Transducción retroviral de células B del bazo como se describe y representa en la figura 1 es un método genético que es útil en el estudio de los linfocitos B, porque muchos de los acontecimientos de desarrollo en lymphopoesis son controlados por la regulación transcripcional de 1, 2. En las últimas etapas de maduración de las células B, activación a través de CD40L es esencial para la inducción del crecimiento de las células B, la entrada en el ciclo celular y la proliferación …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
CK es apoyado por la Universidad de Columbia programa de postgrado. UB es miembro de la Leukemia and Lymphoma Society of America, el destinatario del Premio al Investigador de la Fundación Nueva Investigación de Leucemia y el apoyo de la Universidad de Columbia de Nueva Facultad de fondos iniciales.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| FCS | Atlanta Biologicals | S11550 | ||
| RPMI | Invitrogen/Gibco | 22400 | ||
| PBS | Invitrogen/Gibco | 20012 | ||
| Red Blood Cell (RBC) lysis buffer | Sigma Aldrich | R7757 | ||
| CD43 beads | Miltenyi | |||
| B Cell Complete Media | Various components | Various Components | RPMI, 15% FCS, 1% Non-Essential Amino Acids, 1% Sodium Pyruvate, 1% HEPES, 1% Pen-Strep, 50μM β-Mercaptoethanol | |
| IL-4 | ||||
| Anti-CD40 | BD Pharmigen | 553787 | ||
| polybrene | Sigma Aldrich | 107689 | ||
| Chloroquine diphosphate salt | Sigma Aldrich | C6628 | Used at 100mM | |
| Phoenix Eco cells (Murine) | Orbigen | RVC-10002 | ||
| PE-Cy5-α-mouse-CD45R (B220) | eBioscience | 15-0452-81 | ||
| PE-α-mouse-IgG1 | BD Pharmigen | A85-1 |
Referencias
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