Recombinante de production et infection rétrovirale des cellules B
Summary
Un système efficace de structure et de l'analyse fonctionnelle d'un gène dans une<em> Ex vivo</em> Culture des lymphocytes B spléniques est décrite. Cette méthode tire parti de la production recombinante dans un aide-rétroviraux gratuits, ligne de conditionnement de cellules écotrophique. Stable, héréditaires expression d'un gène d'intérêt au sein des lymphocytes primaires est réalisée conduisant à la génération d'anticorps de surface sur les cellules B subissant la commutation isotypique.
Abstract
L'expression des gènes transgéniques dans les cellules eucaryotes est un puissant démarche de génétique inverse dans lequel un gène d'intérêt est exprimé sous le contrôle d'un système d'expression hétérologue pour faciliter l'analyse du phénotype résultant. Cette approche peut être utilisée pour exprimer un gène qui n'est pas normalement trouvé dans l'organisme, d'exprimer une forme mutante d'un produit du gène, ou de sur-expriment une forme dominante-négative du produit du gène. Il est particulièrement utile dans l'étude du système hématopoïétique, où la régulation transcriptionnelle est un mécanisme de contrôle majeur dans le développement et la différenciation des cellules B 1, a examiné en 2-4.
Génétique de la souris est un outil puissant pour l'étude des gènes humains et des maladies. Une analyse comparative de la souris et le génome humain révèle conservation de la synténie dans plus de 90% du génome 5. En outre, la plupart des technologies utilisées dans les modèles de souris est applicable à l'étude des gènes humains, par exemple, les perturbations des gènes et de remplacement allélique 6 . Toutefois, la création d'une souris transgénique nécessite beaucoup de ressources de nature à la fois financière et technique. Plusieurs projets ont commencé à compiler les bibliothèques d'assommer souches de souris (KOMP, EUCOMM, NorCOMM) ou de la mutagenèse induite souches (RIKEN), qui nécessitent de vastes efforts et de collaboration 7. Par conséquent, il est souhaitable d'étudier d'abord le phénotype d'un gène désiré dans un modèle de culture cellulaire de cellules primaires avant de passer à un modèle de souris.
L'ADN rétroviral s'intègre dans l'ADN de l'hôte, de préférence au sein ou à proximité des unités de transcription ou îlots CpG, résultant en stable et héritable l'expression du gène d'intérêt emballé, tout en évitant le silencing transcriptionnel 8 9. Les gènes sont ensuite transcrits sous le contrôle d'un promoteur à haute efficacité antirétrovirale, résultant en un rendement élevé de la transcription et la production de protéines. Par conséquent, l'expression rétroviral peut être utilisé avec les cellules qui sont difficiles à transfecter, fourni les cellules sont dans un état actif lors de la mitose. Parce que les gènes de structure du virus sont contenus dans la lignée cellulaire d'emballage, les vecteurs d'expression utilisée pour cloner le gène d'intérêt ne contiennent pas de gènes de structure du virus, ce qui élimine la possibilité à la fois de révertants virale et augmente la sécurité de travailler avec des surnageants viraux car aucune virions infectieux sont produits 10.
Nous présentons ici un protocole pour la production recombinante rétroviraux et l'infection ultérieure des cellules B spléniques. Après isolement, les cellules cultivées rate sont stimulées par Th. lymphokines dérivées et anti-CD40, ce qui induit un éclatement de la prolifération cellulaire et la différenciation B 11. Ce protocole est idéal pour l'étude des événements survenus en fin de développement des cellules B et la différenciation, les cellules B sont isolées de la rate initiales suivantes évènements hématopoïétiques, mais avant la stimulation antigénique à induire la différenciation plasmocytaire.
Protocol
Discussion
Transduction rétrovirale de cellules B spléniques comme décrit ici et comme le montre la figure 1 est une approche génétique qui est utile dans l'étude des lymphocytes B en raison de nombreux événements de développement dans lymphopoesis sont contrôlés par la régulation transcriptionnelle 1, 2. Dans les derniers stades de la maturation des cellules B, déclenchant via CD40L est essentiel pour l'induction de la croissance des cellules B, l'entrée dans le cycle cellulai…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
CK est soutenu par Columbia University Graduate programme. UB est Fellow de la Société de leucémie et lymphome d'Amérique, le destinataire de bourse de nouveau chercheur de la Fondation recherche sur la leucémie et est soutenu par l'Université de Columbia New Faculté des fonds de démarrage.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| FCS | Atlanta Biologicals | S11550 | ||
| RPMI | Invitrogen/Gibco | 22400 | ||
| PBS | Invitrogen/Gibco | 20012 | ||
| Red Blood Cell (RBC) lysis buffer | Sigma Aldrich | R7757 | ||
| CD43 beads | Miltenyi | |||
| B Cell Complete Media | Various components | Various Components | RPMI, 15% FCS, 1% Non-Essential Amino Acids, 1% Sodium Pyruvate, 1% HEPES, 1% Pen-Strep, 50μM β-Mercaptoethanol | |
| IL-4 | ||||
| Anti-CD40 | BD Pharmigen | 553787 | ||
| polybrene | Sigma Aldrich | 107689 | ||
| Chloroquine diphosphate salt | Sigma Aldrich | C6628 | Used at 100mM | |
| Phoenix Eco cells (Murine) | Orbigen | RVC-10002 | ||
| PE-Cy5-α-mouse-CD45R (B220) | eBioscience | 15-0452-81 | ||
| PE-α-mouse-IgG1 | BD Pharmigen | A85-1 |
Referencias
- Bartholdy, B., Matthias, P. Transcriptional control of B cell development and function. Gene. 327, 1-23 (2004).
- Henderson, A., Calame, K. Transcriptional regulation during B cell development. Annu Rev Immunol. 16, 163-200 (1998).
- Graf, T. Differentiation plasticity of hematopoietic cells. Blood. 99, 3089-30101 (2002).
- Xiao, C., Rajewsky, K. MicroRNA control in the immune system: basic principles. Cell. 136, 26-36 (2009).
- Waterston, R. H. Initial sequencing and comparative analysis of the mouse genome. Nature. 420, 520-562 (2002).
- Griffiths, A. J. F., Miller, J. H., Suzuki, D. T., Lewontin, R. C., Gelbart, W. M. . Introduction to Genetic Analysis. , (2000).
- Gondo, Y. Next-generation gene targeting in the mouse for functional genomics. BMB Rep. 42, 315-3123 (2009).
- Plachy, J. Proviruses selected for high and stable expression of transduced genes accumulate in broadly transcribed genome areas. J Virol. 84, 4204-4211 (2010).
- Felice, B. Transcription factor binding sites are genetic determinants of retroviral integration in the human genome. PLoS One. 4, e4571-e4571 (2009).
- Karavanas, G. Cell targeting by murine retroviral vectors. Crit Rev Oncol Hematol. 28, 7-30 (1998).
- Noelle, R. J. A 39-kDa protein on activated helper T cells binds CD40 and transduces the signal for cognate activation of B cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 6550-6554 (1992).
- Muramatsu, M. Class switch recombination and hypermutation require activation-induced cytidine deaminase (AID), a potential RNA editing enzyme. Cell. 102, 553-563 (2000).
- Yelle, J., Dion, M., Hamelin, C. Efficient transfection of mammalian cells with viral DNA in optimal culture conditions. J Virol Methods. 7, 321-326 (1983).
- Chen, C., Okayama, H. High-efficiency transformation of mammalian cells by plasmid DNA. Mol Cell Biol. 7, 2745-2752 (1987).
- Fagarasan, S. In situ class switching and differentiation to IgA-producing cells in the gut lamina propria. Nature. 413, 639-6343 (2001).
- Basu, U. The AID antibody diversification enzyme is regulated by protein kinase A phosphorylation. Nature. 438, 508-5011 (2005).
- McBride, K. M. Regulation of class switch recombination and somatic mutation by AID phosphorylation. J Exp Med. 205, 2585-2594 (2008).
- Barreto, V. M. AID from bony fish catalyzes class switch recombination. J Exp Med. 202, 733-738 (2005).
- Delphin, S., Stavnezer, J. Regulation of antibody class switching to IgE: characterization of an IL-4-responsive region in the immunoglobulin heavy-chain germline epsilon promoter. Ann N Y Acad Sci. 764, 123-135 (1995).
- Castigli, E. CD40 expression and function in murine B cell ontogeny. Int Immunol. 8, 405-411 (1996).
- Ballantyne, J. Efficient recombination of a switch substrate retrovector in CD40- activated B lymphocytes: implications for the control of CH gene switch recombination. J Immunol. 161, 1336-1347 (1998).
