Sistema alfavirus trasduzione: Strumenti per la visualizzazione di infezione in Vettori Mosquito

Il protocollo che segue è scritto per la produzione e l'uso di un ATS basato sul virus Sindbis MRE16. L'ATS è stato progettato per esprimere la GFP nel vettore zanzara Aedes aegypti. cDNA cloni infettive di un certo numero di alphaviruses (virus Sindbis, virus Chikungunya, O'nyong-nyong virus, virus dell'encefalite equina occidentale) sono attualmente disponibili che sono stati progettati come ATS (Tabella 1). Per ottenere i migliori risultati del DNA plasmidico è amplificato nei batteri come SURE batteri competenti (Stratagene / Agilent Technologies) per evitare indesiderati ricombinazione e la perdita del cDNA virale. Tutti i plasmidi clone infettive hanno un batteriofago T7 o SP6 promotore presso l'immediato 5 'del cDNA virale per la trascrizione del full-length RNA genomico e di una endonucleasi di restrizione unico al 3' per la trascrizione deflusso. Per ogni ATS, gli utenti devono utilizzare il DNA appropriato dipendente batteriofagi RNA polimerasi e endonucleasi di restrizione unico per la trascrizione in vitro del genoma virale RNA. 1. Generazione di RNA infettive da clone cDNA. Linearizzare il 5μg del clone infettivo plasmide (p5'dsMRE16 / GFP) con 20 unità di enzima di restrizione XhoI in una reazione a 100 ul. Incubare per 2-3h a 37 ° C Purificare il DNA linearizzato utilizzando Qiagen QIAprep Spin Miniprep protocollo di purificazione alternativi Kit, eluizione di DNA da Spin Column con 50 microlitri di acqua RNasi-free. Concentrazione plasmide dovrebbero essere circa 1,0 mcg / mL. In un RNasi-free tubo 0,2 ml PCR, set-up a 50 microlitri reazione di trascrizione utilizzando Ambion Kit MAXIscript per protocollo, come segue. 22,5 microlitri RNasi-free dH 2 O Modello 5,0 microlitri di DNA linearizzato (1,0 mg / mL) 2,5 microlitri 10mM ATP 2,5 microlitri 10mM CTP 2,5 microlitri 10mM UTP 2,5 microlitri 1 mM GTP 2,5 microlitri 10mM tappo analogico (m 7 G (5 ') ppp (5') G) 5,0 microlitri di buffer trascrizione 10X 5,0 microlitri T7 o SP6 mix polimerasi Totale 50,0 microlitri Incubare la reazione di trascrizione per 1 ora a 37 ° C. Dopo l'incubazione, la reazione deve essere utilizzato immediatamente per l'elettroporazione di cellule BHK-21. Preparazione del cellule BHK-21 per l'elettroporazione dovrebbero iniziare durante la reazione di incubazione trascrizione. 2. Generazione di virus da RNA infettive Trypsinize due 70-80% confluenti 150 centimetri 2 (T-150) Pallone BHK-21 cellule per ATS. Trasferire tutte le cellule in una provetta da centrifuga da 15 ml. Agglomerare le cellule mediante centrifugazione a 2000 rpm, 10 min, 4 ° C in una centrifuga da tavolo tradizionali. Risospendere le cellule in PBS sterile senza Mg + + e Ca + +. Ripetere i passi 2.3 e 2.4 fino a quando le cellule sono state lavate tre volte con PBS. Risospendere il pellet cellule 0,5 ml di MEM contenente 10% FBS. Diluire 10 celle con 90 microlitri MEM microlitri con il 10% FBS e contare su un emocitometro. Se necessario, le cellule diluire a 2,5-12,5 x 10 7 cellule / ml con MEM contenente 10% FBS. Per un freddo ghiaccio 0,2 centimetri cuvetta elettroporazione, aggiungere 400 microlitri di sospensione cellulare e 20 microlitri reazione di trascrizione. Pulire condensa cuvetta. Pulse la cuvetta due volte: 450V, 1200Ω, 150 uF. Usiamo un manipolatore Electro Cell, Harvard Apparatus modello ECM630. Posizionare l'intero contenuto della cuvetta in un centimetro 25 2 fiasco di coltura contenente 5 ml di MEM con il 10% FBS. Pallone incubare (s) a 37 ° C con 5% di CO 2. Monitorare l'infezione quotidiano utilizzando un microscopio invertito a fluorescenza con adeguate set di filtri (es. GFP filtro: lunghezza d'onda di eccitazione = 460-490 nm, emissione = lunghezza d'onda di 510-550 nm o DsRed filtro: lunghezza d'onda di eccitazione = 460-560 nm, emissione = lunghezza d'onda> 590 nm). Quando fluorescenza suggerisce infezione è confluenti e / o CPE è visibile in tutto il pallone, raccogliere il contenuto del flacone, aggiungere il 30% FBS, aliquota, se necessario, e conservare a -80 ° C. Se lo si desidera, lisati di cellule possono essere cancellati per centrifugazione (2000 rpm, 10 min, 4 ° C) prima dell'aggiunta di FBS. Passaggio del virus almeno una volta attraverso un pallone nuovo di cellule per aumentare il titolo del virus per le analisi successive alimentazione sangue. 3. Per os infezione di zanzare Mescolare sangue (di solito acquistata de-fibrinated sangue di pecora) e coltura cellulare sospensione del virus derivato dal punto 2.13. Titolo finale del virus nel sangue pasto tipicamente dovrebbe essere ~ 1×10 7 unità placca formando (PFU) / mL per infezione midgut efficiente della zanzara. Per stimolare le zanzare a congestionare, adenosina 5'-trifosfato (ATP) può essere aggiunto a una concentrazione finale di 0.02M. Le zanzare possonodevono essere privato di acqua e zucchero prima dell'infezione per stimolarli ad alimentare in modo efficiente il sangue da un alimentatore artificiale. Durata della privazione dovrebbero essere stabiliti in precedenza per ridurre al minimo la mortalità. Tempi dipenderanno specie di zanzare, l'umidità del ecc insectary Come punto di partenza, togliere 24h 12h zucchero e acqua prima al feed. Questo protocollo utilizza l'acqua con camicia in vetro feeders17 con circolare acqua a 37 ° C. Una membrana intestinale suina (cioè lavati a fondo salsiccia involucro disponibile nei negozi di alimentari più) viene posto sulla bocca di alimentazione e il pasto è pipettato nella camera. Vari disegni, membrane e protocolli sono disponibili per i tipi di vettori differenti. Le zanzare sono ordinati per selezionare solo quelle zanzare gonfio di sangue. Engorged zanzare vengono trasferiti in un cartone con organza sulla parte superiore e le zanzare sono incubate a 28 ° C, il 75-80% di umidità relativa fino trattati per l'espressione della GFP. 4. Inoculazione intratoracica delle zanzare Inoculazione intratoracica è un metodo alternativo per infettare il artropodi. Questo metodo viene utilizzato quando la divulgazione attraverso il midgut non è necessaria. (Metodo descritto di seguito, ma la tecnica non viene mostrato in questo esperimento visivo). Un piccolo numero di zanzare (5-10) viene aspirato dalle gabbie un'azienda nella tubi di plastica in mano. I tubi sigillati tenendo verranno messi a 4 ° C per 15 minuti per raffreddare le zanzare. 2 5 zanzare sarà versato dal tubo su un piatto di vetro Petri poggia su ghiaccio. Mettere il coperchio sulla piastra Petri quando non in uso o se le zanzare cominciano a muoversi. Durante la movimentazione delle zanzare, è necessario prestare attenzione a contare e tenere traccia del numero di zanzare viene manipolato. Come le zanzare sono rovesciato sul tavolo freddo, il numero totale sarà registrato su un bancone di laboratorio. L'ago viene preparato sciogliendo tubo capillare di vetro utilizzando specifici Nanoject e un estrattore ago. Impostare il Nanoject II microinjector secondo le istruzioni del produttore per la consegna di 69 nL inoculo. La cura deve essere esercitata quando l'inoculo nel disegno l'ago in modo che l'ago non sia danneggiato. Utilizzando un microscopio da dissezione, inserire l'ago nel torace della zanzara e attivare il Nanoject per l'inoculazione. La cura deve essere esercitata quando inoculare le zanzare in modo che l'ago non penetra completamente la zanzara e uscire dall'altra parte, provocando la successiva morte della zanzara. Controllare ogni zanzara per essere sicuri che l'inoculo è entrato prima di rimuoverla dal ago. Dopo l'inoculazione, mentre la zanzara è ancora impalato sul ferro, è posto in una scatola di carta di partecipazione mediante un piccolo foro nel fianco che è collegato con cotone o un tappo di sughero in tutti gli altri. Quando le zanzare hanno inoculato e messo in cartone (fino a circa il 50 per scatola), con attenzione nastro il tappo in atto per evitare il rilascio accidentale delle zanzare. Posizionare i cartoni in un bidone presa sicura prima di incubazione ulteriormente nel insectary a 28 ° C e 80% di umidità relativa. 5. Infezione monitoraggio delle zanzare Posizionare la scatola di carta mantenimento a 4 ° C per circa 15 minuti per immobilizzare le zanzare. Trasferire un piccolo numero di zanzare (5-10 alla volta) a un tavolo freddo adattati per essere utilizzati su un microscopio a fluorescenza. Esaminare e ordinare le zanzare in base alla presenza o assenza di fluorescenza. Inoltre, fluorescente di intensità può essere utilizzato come una misura quantitativa procura di infezione. Tessuti zanzara come midguts, ghiandole salivari, di grasso corporeo può essere sezionato e monitorati per fluorescenza. Se del caso, il ritorno zanzare selezionati al cartone carta per continuare l'incubazione di zanzare infette. 6. Trasmissione Assay (salivazione Costretto a dimostrare la trasmissione del virus) Privare le zanzare di fonte zucchero per 24 ore prima da sfamare. Rimuovere le gambe e le ali Per un tubo di 50 microlitri capillare che è stato riscaldato, tirato e tagliato ad una estremità, aggiungere 3-5 ml di olio di immersione Cargille tipo B o 10% di siero-soluzione di saccarosio. Inserire la proboscide nel tubo. Se si utilizza l'olio, le goccioline di saliva si vedrà a trasudare dalla proboscide. Un ml di una soluzione pilocarbine 1% in PBS e Tween 80 0,1% può essere applicato al torace per stimolare. Dopo 60-90 minuti, togliere le zanzare e conservare per l'isolamento del virus, se necessario. Rimuovere la soluzione dal tubo per centrifugazione in un tubo contenente 100 ul 20% di FBS-PBS. Filtro sterile l'inoculo attraverso un filtro a siringa da 0,2 micron e quindi utilizzare il filtrato l'inoculo di infettare le cellule in coltura. BIOSICUREZZA NOTA: Questo protocollo descriveun metodo per la generazione, l'identificazione e il monitoraggio zanzare infette. Sulla base delle vostre strutture (ad esempio un tavolo freddo, impianto di contenimento, ecc) e l'approvazione IBC, si può essere limitata ad esaminarle solo dopo aver rimosso le ali e le gambe per evitare la fuga. SINV a base di ATS può essere generata e utilizzata in un ambiente BSL2. L'uso di ATS, basata su alphaviruses altri come la Chikungunya virus o virus dell'encefalite equina occidentale richiederà BSL3 strutture. 7. Rappresentante Risultati Una panoramica di espressione di un gene marcatore (GFP) utilizzando il 5'dsMRE16 ATS / GFP è mostrata in Figura 1. Espressione della GFP in BHK-21 e C6/36 (Aedes albopictus), le cellule è mostrato nella Figura 2 in determinati momenti dopo l'infezione di cellule con 5'dsMRE16 / GFP virus a 0,01 molteplicità di infezione. Figura 3 è una panoramica di infezione da virus alfavirus e ATS nella zanzara, quando il virus è espresso attraverso un pasto di sangue infettiva. La Figura 4 mostra la preparazione di un pasto di sangue con ~ 10 7 pfu / ml di virus ATS seguita da infezione orale di Aedes aegypti. Corpo vista intera di zanzara infetta e parti del corpo selezionato a 10 giorni dall'infezione utilizzando un microscopio a epifluorescenza (Figura 5). Rilevazione di tali pratiche e DsRed in midguts di zanzare infette dopo l'infezione con virus ATS 5'dsMRE16 esprimere ogni gene marcatore fluorescente (Figura 6). Test di trasmissione con zanzare infette con 5'dsMRE16 / GFP ATS virus (Figura 7). Tabella 1. ATS attualmente progettati per l'espressione genica nelle zanzare.   Alfavirus ATS Zanzara Riferimento Sindbis Virus TE / 3'2J e TE / 5'2J Aedes aegypti 12 Ochlerotatus triseriatus 13 3'dsMRE16 e 5'dsMRE16 A. aegypti 5 Culex tritaeniorhynchus 5 5'dsTR339 A. aeg ypti 2 Virus Chikungunya 3'dsCHIKV e 5'dsCHIKV A. aegypti / A. albopictus 20 O'nyong nyong virus 5'dsONNV Anopheles gambiae 1,9 Encefalite equina occidentale virus 5'dsWEEV. McMillan Culex tarsalis Stauft et al. Inediti Tabella 2. Vantaggi / svantaggi di usare ATS per l'espressione genica nelle zanzare. Vantaggi: Produzione rapida di virus ad alto titolo Ospitare un'ampia gamma (SINV) Alto tasso di replicazione RNA Elevati livelli di espressione del transgene Relativa facilità di manipolare geni Stabile, l'espressione genica persistente negli insetti Patologia minima negli insetti Svantaggi: A breve termine la modalità di espressione nelle cellule dei vertebrati Forte effetto citopatico sulle cellule dei vertebrati Gene restrizioni di dimensione (<1Kb, idealmente) Alcuni alphaviruses richiedono BSL3 contenimento Figura 1: Panoramica della produzione di virus ATS in cellule BHK-21 utilizzando p5'dsMRE / GFP GFP SINV esprimere. Seguendo la trascrizione in vitro, genomica ATS RNA è elettroporate in cellule BHK-21, dove viene salvato virus. Il virus ATS può quindi essere utilizzato per infettare le zanzare. PSC = promotore subgenomic. Tre ATS specie di RNA sono trascritti nel cells, la genomica, subgenomic 1 e 2 subgenomic RNA. C (capside), glicoproteine ​​E1 ed E2 sono assemblati con ATS genoma per generare virus infettivo. Figura 2: L'espressione di GFP in zanzara (C6/36), le cellule dopo l'infezione con SINV 5'dsMRE16 / GFP virus. Figura 3: Panoramica di una infezione da virus ATS nelle zanzare porta alla trasmissione del virus. Figura 4: ATS SINV 5'dsMRE16 infezione esponendo le zanzare per un pasto di sangue infettiva. Figura 5: ATS SINV 5'dsMRE16 / GFP infezione a 10 giorni dall'infezione. Rilevamento intero corpo di GFP mostra che il virus è sfuggito midgut e diffuso ai tessuti secondari. La figura mostra anche l'espressione della GFP in parti del corpo scelto che è anche indicativo di una infezione disseminata. Figura 6: ATS SINV 5'dsMRE16 / GFP e 5'dsMRE16 / infezione DsRed di midguts in momenti specifici di post-infezione. Midguts di solito hanno diversi focolai di infezione precoce dopo aver ingerito un pasto di sangue contenente virus che si diffonde in tutto il midgut posteriore in tempi successivi post-infezione. Figura 7: Riconoscimento di ATS 5'dsMRE16 / GFP nella saliva della zanzara a partire da 8 giorni dall'infezione. Saggio è stato progettato per mostrare la trasmissione del virus ATS e mostra che il 5'dsMRE16 / GFP virus può esprimere stabilmente GFP per tutto il periodo di incubazione estrinseca nella zanzara. Il pannello di sinistra mostra una zanzara salivazione in un tubo capillare, il pannello centrale mostra C6/36 cellule infette con la saliva a 1 giorno e pannello di destra 3 giorni dopo l'infezione.