Alphavirus transduzierenden System: Werkzeuge für die Visualisierung Infektion in Mosquito Vektoren

Das folgende Protokoll ist für die Produktion und Verwendung eines ATS auf der Sindbisvirus MRE16 Basis geschrieben. Die ATS ist für GFP in der Mücke Aedes aegypti auszudrücken. cDNA-Klone Infectious einer Reihe von Alphaviren (Sindbis Virus, Chikungunya-Virus, O'nyong-nyong Virus, West-Pferde-Enzephalitis-Virus) sind derzeit zur Verfügung, die als ATS (Tabelle 1) konzipiert. Für beste Ergebnisse Plasmid-DNA in Bakterien wie SURE kompetente Bakterien (Stratagene / Agilent Technologies), um unerwünschte Rekombination und Verlust der viralen cDNA vermeiden verstärkt. Alle infektiösen Klon Plasmide haben einen Bakteriophagen T7 oder SP6-Promotor in der unmittelbaren 5'-Ende des viralen cDNA für die Transkription von full-length genomischen RNA und einem einzigartigen Restriktionsendonuklease am 3 'Ende für Abfluss-Transkription. Für jeden ATS, müssen die Benutzer den entsprechenden Bakteriophagen-DNA abhängigen RNA-Polymerase und einzigartigen Restriktionsendonuklease für in vitro-Transkription der viralen RNA-Genom. 1. Generation of Infectious RNA aus cDNA Klonen. Linearisieren der 5μg der infektiösen Klon Plasmid (p5'dsMRE16 / GFP) mit 20 Einheiten Restriktionsenzym XhoI in einer 100 ul-Reaktion. Inkubieren für 2-3h bei 37 ° C Purify linearisierte DNA mittels Qiagen QIAprep Spin Miniprep Kit alternative Aufreinigungsprotokolls, eluting DNA aus Spin-Säule mit 50 ul RNase-freiem Wasser. Plasmid-Konzentration sollte etwa 1,0 ug / ul werden. In ein RNase-freies 0,2 ml PCR-Röhrchen, Set-up mit 50 ul Transkriptionsreaktion mit Ambion MAXIscript Kit pro Protokoll wie folgt. 22,5 ul RNase-freies dH 2 O 5,0 ul linearisierte DNA-Template (1,0 ug / ul) 2,5 ul 10 mM ATP 2,5 ul 10 mM CTP 2,5 ul 10 mM UTP 2,5 ul 1 mM GTP 2,5 ul 10 mM Kappe analog (m 7 G (5 ') ppp (5') G) 5,0 ul 10x Transkriptionspuffer 5,0 ul T7-oder SP6-Polymerase-Mix 50,0 ul insgesamt Inkubieren Sie die Transkription für 1 Stunde bei 37 ° C. Nach der Inkubation sollte die Reaktion sofort für die Elektroporation von BHK-21 Zellen verwendet werden. Vorbereitung der BHK-21-Zellen für die Elektroporation sollte während der Inkubation Transkriptionsreaktion beginnen. 2. Erzeugung von Virus aus Infectious RNA Trypsinize zwei 70-80% konfluente 150 cm 2 (T-150) Kolben BHK-21 Zellen pro ATS. Übertragen Sie alle Zellen in ein 15 ml konisches Zentrifugenröhrchen. Pellet die Zellen durch Zentrifugation bei 2000 rpm, 10 min, 4 ° C in einer herkömmlichen Tischzentrifuge. Die Zellen in sterilem PBS ohne Mg + + und Ca + +. Wiederholen Sie die Schritte 2,3 und 2,4, bis die Zellen wurden dreimal mit PBS gewaschen. Resuspendieren der pelletierten Zellen 0,5 ml MEM mit 10% FBS. Verdünnen Sie 10 l-Zellen mit 90 ul MEM mit 10% FBS und zählen auf einem Hämacytometer. Falls notwendig, verdünnen Zellen 2,5-12,5 x 10 7 Zellen / ml mit MEM mit 10% FBS. Um ein eiskaltes 0,2 cm Elektroporationsküvette, fügen Sie 400 ul Zellsuspension und 20 ul Transkriptionsreaktion. Wischen Kondensation von Küvette. Pulse die Küvette zweimal: 450V, 1200Ω, 150 uF. Wir verwenden ein Electro Zellmanipulators, Harvard Apparatus Modell ECM630. Platzieren Sie den gesamten Inhalt der Küvette in eine 25 cm 2 Zellkulturflasche mit 5 ml MEM mit 10% FBS. Inkubieren Kolben (s) bei 37 ° C mit 5% CO 2. Überwachen Sie die Infektion täglich mit einem inversen Fluoreszenzmikroskop mit geeigneten Filter-Set (zB GFP-Filter: Anregungswellenlänge = 460-490 nm, Emissionswellenlänge = 510-550 nm; oder dsRed Filter: Anregungswellenlänge = 460-560 nm, Emissionswellenlänge => 590 nm). Als Fluoreszenz schlägt Infektion ist konfluent und / oder CPE ist sichtbar in den Kolben, sammeln die Inhalte der aufgefangen und mit 30% FBS, Aliquot wie nötig, und bei -80 ° C. Falls gewünscht, kann Zelllysate durch Zentrifugation geklärt werden (2000 rpm, 10 min, 4 ° C) vor der Zugabe von FBS. Passage-Virus mindestens einmal durch eine neue Flasche von Zellen, die Virustiter für nachfolgende Blut Fütterung Assays zu erhöhen. 3. Per os Infektion der Mücken Mischen Blut (in der Regel gekauft de-fibrinated Schafblut) und Zellkultur-abgeleitete Virus Suspension aus Schritt 2.13. Finale Virustiter in der Blutmahlzeit in der Regel sollte ~ 1×10 7 Plaque-bildenden Einheiten (pfu) / mL für eine effiziente Infektion Mitteldarm der Mücke werden. Zur Stimulierung Mücken engorge, Adenosin-5'-Triphosphat (ATP) kann bis zu einer Endkonzentration von 0,02 M hinzugefügt werden. Mücken könnenhaben, um aus Wasser und Zucker entzogen werden vor der Infektion, um sie effizient Blut ernähren stimulieren aus einer künstlichen einlegen. Dauer des Entzugs sollte vorher festgelegt werden, um die Sterblichkeit zu minimieren. Die Zeiten werden auf Mückenarten, Feuchtigkeit der Insektarium etc. Als Ausgangspunkt ab, entfernen Sie Zucker und Wasser 24 Stunden 12h vor dem zu ernähren. Dieses Protokoll verwendet Wassermantel Glas feeders17 mit umlaufendem 37 ° C Wasser. Ein Schweine-Darm-Membran (dh gründlich gewaschen Wursthülle in den meisten Lebensmittelgeschäften) wird über den Mund des Zubringers und das Essen wird in die Kammer pipettiert platziert. Verschiedene Ausführungen, Membranen und Protokolle für verschiedene Vektor-Typen zur Verfügung. Moskitos sind sortiert, um nur die Mücken mit Blut gefüllt wählen. Engorged Mücken sind ein Karton mit Organza auf der Spitze übertragen und die Mücken sind bei 28 ° C, 75-80% relative Luftfeuchtigkeit bis auf GFP-Expression verarbeitet. 4. Intrathorakale Inokulation von Mücken Intrathorakale Impfung ist eine alternative Methode zur Infektion der Arthropoden. Diese Methode wird verwendet, wenn die Verbreitung durch den Mitteldarm nicht erforderlich ist. (Methode beschrieben, aber die Technik ist noch nicht in diesem visuelles Experiment gezeigt). Eine kleine Anzahl von Mücken (5-10) ist aus dem Betrieb Käfige in Kunststoff Holding Rohre angesaugt. Die versiegelten hält Röhrchen bei 4 ° C für 15 min die Moskitos Chill auf. 2 5 Moskitos aus der Tube auf eine Glas-Petrischale ruht auf Eis verschüttet werden. Setzen Sie den Deckel auf die Petrischale, wenn nicht in Gebrauch ist oder wenn Mücken zu bewegen beginnen. Während der Handhabung von Mücken, muss darauf geachtet werden, zu zählen und zu verfolgen die Zahl der Mücken manipuliert werden. Wie Mücken auf der Chill Tisch verschüttet werden, wird die Gesamtzahl auf dem Labortisch aufgezeichnet werden. Die Nadel wird durch Schmelzen Kapillarrohr mit Nanoject spezifische Glas-und einer Nadel puller vorbereitet. Richten Sie die Nanoject II Mikroinjektor pro Anweisungen des Herstellers für die Lieferung von 69 nL Inokulum. Vorsicht ist bei der Erstellung des Inokulums in die Nadel so, dass die Nadel nicht beschädigt wird. Mit einem Binokular die Nadel in den Brustkorb von der Mücke und aktivieren Sie die Nanoject zur Impfung. Vorsicht ist bei der Impfung Mücken, so dass die Nadel nicht vollständig durchdringen die Mücke und Ausfahrt der anderen Seite, was in der anschließenden Tod der Mücke werden. Prüfen Sie jede Mücke sicher sein, dass das Inokulum, bevor es aus der Nadel eingetragen. Nach der Impfung während der Mücke ist noch auf der Nadel aufgespießt, legen Sie es in einem Papier Holding Karton durch ein kleines Loch in die Seite, die mit Watte oder einem Korken zu allen anderen Zeiten angeschlossen ist. Wenn die Mücken haben geimpft und in den Karton (bis zu ca. 50 pro Karton), sorgfältig Band der Korken in Ort, um ein unbeabsichtigtes Lösen der Mücken zu verhindern platziert. Legen Sie die Kartons in einen sicheren Halt bin vor einer weiteren Inkubation im Insektarium bei 28 ° C und 80% relativer Luftfeuchtigkeit. 5. Überwachung der Infektion der Mücken Legen Sie das Papier hält Karton bei 4 ° C für ca. 15 Minuten, um Mücken zu immobilisieren. Übertragen einer kleinen Anzahl von Mücken (5-10 auf einmal) zu einem Chill-Tabelle für den Einsatz auf einem Fluoreszenz-Mikroskop angepasst. Untersuchen und sortieren Mücken auf Vorhandensein oder Fehlen von Fluoreszenz. Darüber hinaus kann Fluoreszenzintensität als Proxy quantitative Messung der Infektion verwendet werden. Mosquito Geweben wie Mitteldärmen, Speicheldrüsen, können fetten Körper seziert und für die Fluoreszenz beobachtet werden. Gegebenenfalls wieder gewählt Mücken auf Papier Karton zur Inkubation von infizierten Mücken weiter. 6. Transmission Assay (Forced Speichelfluss auf eine Übertragung des Virus zu demonstrieren) Entziehen Sie Mücken Zucker Quelle für 24 h vor zu füttern. Entfernen Sie Beine und Flügel Um eine 50 ul Kapillare, die erhitzt wurde, zog und schnitt an einem Ende, fügen Sie 3-5 ul der Cargille Typ B Immersionsöl oder 10% Serum-Saccharose-Lösung. Legen Sie den Rüssel in die Röhre. Bei der Verwendung von Öl, wird Tröpfchen Speichel gesehen vom Rüssel ausstrahlen werden. Ein ul einer 1% igen pilocarbine Lösung in PBS und 0,1% Tween 80 kann auf den Thorax zu stimulieren angewendet werden. Nach 60-90 Minuten, entfernen Mücken und speichern für die Virusisolierung, falls erforderlich. Entfernen Sie aus dem Glas durch Zentrifugation in ein Röhrchen mit 100 ul 20% FBS-PBS. Sterilfilter das Inokulum durch einen 0,2 um Spritzenfilter und verwenden Sie dann das gefilterte das Inokulum zu kultivierten Zellen zu infizieren. Biosafety Hinweis: Dieses Protokoll beschreibtein Verfahren zur Erzeugung, Identifizierung und Überwachung von infizierten Mücken. Basierend auf Ihren Einrichtungen (dh eine Chill-Tabelle, Containment-Anlage, etc.) und IBC Genehmigung, können Sie auf deren Prüfung erst nach Entfernen Flügel und Beine, um eine Flucht zu verhindern begrenzt werden. SINV-basierte ATS erzeugt und verwendet werden in einem BSL2 Umwelt. Der Einsatz von ATS ist auf anderen Alphaviren wie Chikungunya-Virus oder westlichen Pferdeenzephalitis-Viren basieren erfordert BSL3 Einrichtungen. 7. Repräsentative Ergebnisse Eine Übersicht der Expression eines Marker-Gen (GFP) mit dem ATS 5'dsMRE16 / GFP ist in Abbildung 1 dargestellt. Expression von GFP in BHK-21 und C6/36 (Aedes albopictus)-Zellen ist in Abbildung 2 zu bestimmten Zeiten nach der Infektion von Zellen mit 5'dsMRE16 / GFP-Virus bei 0,01 Multiplizität der Infektion gezeigt. Abbildung 3 gibt einen Überblick über Alphavirus und ATS-Virus-Infektion in der Mücke, wenn das Virus durch einen infektiösen Blutmahlzeit geliefert wird. Abbildung 4 zeigt die Herstellung einer Blutmahlzeit mit ~ 10 7 pfu / ml ATS-Virus durch orale Infektion von Aedes aegypti gefolgt. Ganzkörper-Ansicht von infizierten Mücken und ausgewählte Körperteile bei 10 Tagen nach der Infektion mit dem Epifluoreszenzmikroskop (Abbildung 5). Detektion von GFP und DsRed in Mitteldärmen von infizierten Mücken nach Infektion mit ATS 5'dsMRE16 Viren Ausdruck jedes fluoreszierenden Markergen (Abbildung 6). Transmission Test unter Verwendung von Moskitos mit 5'dsMRE16 / GFP ATS-Virus (Abbildung 7) infiziert. Tabelle 1. ATS ist derzeit für die Genexpression in Mücken entwickelt.   Alphavirus ATS Mücke Referenz Sindbis Virus TE / 3'2J und TE / 5'2J Aedes aegypti 12 Ochlerotatus triseriatus 13 3'dsMRE16 und 5'dsMRE16 A. aegypti 5 Culex tritaeniorhynchus 5 5'dsTR339 A. aeg ypti 2 Chikungunya-Virus 3'dsCHIKV und 5'dsCHIKV A. aegypti / A. albopictus 20 O'nyong nyong Virus 5'dsONNV Anopheles gambiae 1,9 Westlichen Pferde-Enzephalitis-Virus 5'dsWEEV. McMillan Culex tarsalis Stauft et al., Unveröffentlichte Tabelle 2. Vorteile / Nachteile der Verwendung von ATS ist für die Genexpression in Mücken. Vorteile: Schnelle Herstellung von High-Titer-Virus Breites Wirtsspektrum (SINV) Hohe RNA-Replikation Rate Hohe Transgenexpression Ebenen Relative Leichtigkeit der Genmanipulation Stabile, anhaltende Genexpression in Insekten Minimal Pathologie in Insekten Nachteile: Kurzfristige Ausdruck Modus in Zellen von Wirbeltieren Starke zytopathischen Wirkungen auf Zellen von Wirbeltieren Gene Größenbeschränkungen (<1 KB, im Idealfall) Einige Alphaviren erfordern BSL3 Containment Abbildung 1: Übersicht über ATS Virus-Produktion in BHK-21 Zellen mit p5'dsMRE / GFP SINV, die GFP. Nach in-vitro-Transkription ist die genomische ATS-RNA in BHK-21 Zellen, in denen Virus ist gerettet elektroporiert. Die ATS-Virus kann dann verwendet werden, um Mücken zu infizieren. SGP = subgenomische Promotor. Drei ATS RNA-Spezies sind in die cel transkribiertls, die genomische, subgenomische 1 und 2 subgenomische RNAs. C (Kapsid), E2-und E1-Glykoproteine ​​mit ATS Genom versammelt, um infektiöse Viren zu generieren. Abbildung 2: Expression von GFP in Mücke (C6/36) Zellen nach Infektion mit SINV 5'dsMRE16 / GFP-Virus. Abbildung 3: Übersicht der ATS-Virus-Infektion in Mücken was zu Virusübertragung. Abbildung 4: ATS SINV 5'dsMRE16 Infektion durch Aussetzen Mücken zu einer infektiösen Blutmahlzeit. Abbildung 5: ATS SINV 5'dsMRE16 / GFP-Infektion bei 10 Tagen nach der Infektion. Die Ganzkörper-Detektion von GFP zeigt, dass Virus hat den Mitteldarm entkommen und verbreitet, um sekundäre Gewebe. Abbildung zeigt auch die GFP-Expression in ausgewählten Körperteile, die auch ein Hinweis auf eine disseminierte Infektion. Abbildung 6: ATS SINV 5'dsMRE16 / GFP und 5'dsMRE16 / dsRED Infektion Mitteldärmen zu bestimmten Zeiten nach der Infektion. Mitteldärmen haben in der Regel deutliche Infektionsherde früh nach Einnahme einer Blutmahlzeit mit Viren, die in den hinteren Mitteldarm zu späteren Zeitpunkten nach der Infektion ausbreitet. Abbildung 7: Erkennung von ATS 5'dsMRE16 / GFP in Mücke Speichel bereits nach 8 Tagen nach der Infektion. Assay wurde entwickelt, um die Übertragung der ATS-Virus und zeigt, dass die 5'dsMRE16 / GFP-Virus stabil exprimieren können GFP während der extrinsischen Inkubationszeit in der Mücke zu zeigen. Die linke Tafel zeigt eine Mücke salivating in ein Kapillarrohr, zeigt das Zentrum Panel C6/36 Zellen mit Speichel an 1 Tag und rechte Tafel 3 Tage nach der Infektion infiziert.