La transfection et la mutagenèse des gènes cibles dans les cellules de moustiques en Fermés d'acide nucléique modifiés Oligonucléotides
Summary
Oligonucléotides peuvent être utilisés pour le site spécifiquement le remplacer par un seul nucléotide des gènes cibles transfectées dans les deux<em> Anopheles gambiae</em> Et<em> Anopheles stephensi</em> Cellules.
Abstract
Parasites du genre Plasmodium, l'agent causal de la malaria, sont transmis par les piqûres de moustiques anophèles infectés résultant dans plus de 250 millions de nouvelles infections chaque année. Malgré des décennies de recherche, il n'ya toujours pas de vaccin contre le paludisme, en soulignant la nécessité de stratégies de contrôle roman. Une approche novatrice est l'utilisation de moustiques génétiquement modifiés pour lutter efficacement contre la transmission du parasite du paludisme. Altérations délibérées des voies de signalisation cellulaire chez le moustique, en passant par mutagenèse ciblée, ont été trouvés pour réguler le développement du parasite 1. De ces études, nous pouvons commencer à identifier les gènes cibles potentiels pour la transformation. Mutagenèse ciblée a toujours compté sur la recombinaison homologue entre un gène cible et une molécule d'ADN à grande. Cependant, la construction et l'utilisation de ces molécules d'ADN complexes pour la production de lignées de cellules transformées de façon stable est coûteux, fastidieux et souvent inefficace. Par conséquent, une stratégie utilisant des acides nucléiques verrouillés-oligonucleotides modifiés (LNA-ons) fournit une alternative utile pour l'introduction artificielle seule substitutions nucléotidiques dans épisomiques et chromosomiques cibles gène d'ADN (revue en 2). LNA-SUR-médiée mutagenèse ciblée a été utilisée pour introduire des mutations ponctuelles dans des gènes d'intérêt dans les cellules cultivées à la fois de la levure et de souris 3,4. Nous montrons ici que LNA-Ons peut être utilisé pour introduire un changement d'un seul nucléotide dans une cible transfectées épisomique qui se traduit par un interrupteur du bleu de protéines (BFP) l'expression fluorescentes pour la protéine verte (GFP) l'expression fluorescentes dans les deux Anopheles gambiae et Anopheles stephensi cellules . Cette conversion démontre pour la première fois que la mutagenèse efficace de gènes cibles dans les cellules de moustique peut être médiée par LNA-ons et suggère que cette technique peut être applicable à la mutagenèse des cibles chromosomiques in vitro et de vivo.
Protocol
Discussion
Nous présentons ici une méthode in vitro et des preuves pour la conversion ciblée d'un seul nucléotide dans un gène cible épisomique après transfection de LNA-Ons dans A. stephensi et A. cellules gambiae. Conversion génique LNA-SUR-médiation nécessite l'induction d'un site spécifique de réponse réparation de l'ADN; nos données indiquent que les cellules de moustique peut soutenir ce mécanisme de mutagenèse dirigée. Bien que la méthode présen…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous tenons à remercier Abbie Spinner au Centre National Primate Research en Californie, pour son aide à la cytométrie de flux. Cette étude a été soutenue par un financement de l'Institut national des allergies et maladies infectieuses (NIAID) des National Institutes of Health (NIH) AI073745, AI080799 et AI078183.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Effectene transfection reagent | Qiagen | 301425 | ||
| GFP control plasmid (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-neg) | Invitrogen | K4935-00 | ||
| BFP plasmid (pcDNA5/FRT/TO) | Gift from Dr. Concordet3 | |||
| LNA-ONs | Gift from Dr. Concordet3 | |||
| MEM, Earle’s w/ glutamine | Invitrogen | 11095 | ||
| Fetal calf serum (FCS) | Invitrogen | 16000 | ||
| Schneider’s Drosophila medium | Invitrogen | 11730 | ||
| Non-essential amino acids | Invitrogen | 11140 | ||
| 10% D-glucose | Sigma | G5767 | ||
| Penicillin-streptomycin antibiotic | Invitrogen | 15140 | ||
| 6-well culture plates | Corning | 3516 |
Referencias
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