Percoll 그라디언트를 사용하여 두뇌와 척수 Mononuclear 세포의 분리
Summary
현재 문서는 효율적으로 효과적으로 흐름 cytometric 분석을 위해 활용할 수 뇌 및 척수 조직에서 mononuclear 세포를 분리하기 위해 빠른 프로토콜을 설명합니다.
Abstract
감염, 외상, autoimmunity 또는 neurodegeneration 동안 중추 신경계 (CNS)를 침투 면역 세포의 분리는 종종 자신의 표현형 및 이펙터 기능을 정의해야합니다. Histochemical 접근 침투 세포의 위치를 파악하고 병리 관련 CNS를 분석하는 수단입니다. 그러나, 원위치 histochemistry과 immunofluorescent 얼룩 기술은 특정 조직에 면역 세포 subtypes을 특성화하기 위해 한 번에 사용할 수있는 항체의 숫자에 의해 제한됩니다. 따라서, 유동세포계측법에 의해 면역 – phenotyping와 함께 histological 접근 방법이 완전히 지역 CNS의 침투의 조성을 특성화하기 위해 중요하다. 이 프로토콜은 discontinous percoll 그라디언트를 통해 CNS 세포 suspensions의 분리에 따라 달라집니다. 현재 문서는 효율적으로 효과적으로 유동세포계측법하여 하나의 샘플에서 다양한 면역 세포 집단의 식별을 위해 활용할 수있는 두뇌 및 척수 조직에서 mononuclear 세포를 분리하기 위해 빠른 프로토콜을 설명합니다.
Protocol
Discussion
정상 및 염증 마우스 조직에서 CNS의 leukocytes의 세포 표면 마커의 분석은 1-3 몇 수십 년 동안 이용되었다. 격리 프로토콜은 밀도 원심 분리에 의해 4 microglia 및 leukocytes의 분리에 근거하고 있습니다. 여기 불연속 percoll의 그라디언트를 사용하여 CNS의 leukocytes를 격리의 신속하고 효과적인 방법을 설명합니다. 세포의 분리 후, 각종 항체와 얼룩으로 – 이에 – CD45 이에 국한되지 않음, CD4…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 국립 다중 경화증 협회 (TA AEC에 3021 – A1 / T)와 산 안토니오 텍사스 대학에 의해 지원되었다.
Materials
Tissue homogenization and Gradients
- Percoll (Amersham)
- 10X Hanks’ Balanced Salt Solution, without Calcium and Magnesium (Gibco)
- RPMI Medium 1640, without phenol red (Gibco)
- 7-ml or 15-ml Dounce Tissue Grinders (VWR)
Flow cytometry
- Cell Staining Buffer (Biolegend)
- Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block), BD Pharmingen
- Hemacytometer (Fisher)
- Anti-mouse CD45 (clone 30-F11), CD4 (clone RM4-5), CD19 (clone 6D5), BioLegend
- 10X Phosphate Buffered Saline, without Calcium and Magnesium (Thermo Scientific)
- Paraformaldehyde (Sigma Aldrich)
- Flow cytometry analysis performed with a LSR II (BD Biosciences)
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