Real-time beeldvorming van leukotriënen B 4 Mediated Cel Migratie en BLT1 Interacties met β-arrestine
Summary
Dit document beschrijft de methodologie om de chemotactische respons van leukocyten aan specifieke liganden bepalen en interacties tussen de receptoren op het celoppervlak en cytosolische eiwitten met behulp van live-cell imaging technieken.
Abstract
G-eiwit gekoppelde receptoren (GPCR's) behoren tot de zeven transmembraan eiwit familie en bemiddelen van de transductie van extracellulaire signalen naar intracellulaire reacties. GPCRs controle diverse biologische functies, zoals chemotaxis, intracellulaire calcium release, genregulatie in een ligand afhankelijke manier via heterotrimere G-eiwitten 1-2. Ligand binding leidt tot een reeks van conformationele veranderingen die leiden tot de activering van heterotrimere G-eiwitten die het niveau van de second messengers zoals cyclische adenosine monofosfaat (cAMP), inositol trifosfaat (IP3) en diacyl glycerol (DG) moduleren. Gelijktijdig met de activering van de receptor ligand binding brengt ook een reeks van gebeurtenissen aan de receptor signalering via desensitisatie, beslaglegging en / of internalisatie verminderen. De desensibilisatie proces van GPCR's gebeurt via receptor fosforylatie door G-eiwit receptor kinases (GRKs) en de daaropvolgende binding van β-arrestins 3. β-arrestins zijn cytosolische eiwitten en verplaatsen naar membraan op GPCR activering, te binden aan gefosforyleerd receptoren (de meeste gevallen) is er door het faciliteren van receptor internalisatie 4-6.
Leukotrieen B 4 (LTB 4) is een pro-inflammatoire lipide molecuul afgeleid van arachidonzuur route en bemiddelt haar acties via GPCR's, LTB 4-receptor 1 (BLT1, een hoge affiniteit receptor) en LTB 4-receptor 2 (BLT2, een lage affiniteit receptor ) 7-9. De LTB 4-BLT1 traject is gebleken om kritisch te zijn in verschillende inflammatoire ziekten, waaronder, astma, artritis en atherosclerose 10-17. De huidige paper beschrijft de methoden ontwikkeld om LTB 4-geïnduceerde migratie van leukocyten en de interacties van BLT1 met β-arrestine en receptor translocatie in levende cellen met behulp van microscopische beeldvorming 18-19 te controleren.
Beenmerg afgeleide dendritische cellen uit C57BL / 6 muizen werden geïsoleerd en gekweekt zoals eerder beschreven 20-21. Deze cellen werden getest in live cell imaging methoden om de LTB 4 geïnduceerde cel migratie aan te tonen. De menselijke BLT1 werd getagd met rood fluorescerend eiwit (BLT1-RFP) op C-terminus en β-arrestin1 getagd met groen fluorescerend eiwit (β-arr-GFP) en de beide plasmiden getransfecteerd in Rat basofiele Leukomia (RBL-2H3) cellijnen 18-19. De kinetiek van interactie tussen deze eiwitten en lokalisatie werden gemonitord met behulp van live-cell microscopie video. De methoden in de huidige papieren beschrijven het gebruik van microscopische technieken om de functionele reacties van G-eiwit gekoppelde receptoren in levende cellen te onderzoeken. De huidige paper beschrijft ook het gebruik van Metamorph software om de fluorescentie-intensiteiten te kwantificeren de kinetiek van de receptor en cytosolisch eiwit interacties te bepalen.
Protocol
Discussion
Live-cell imaging is een krachtig hulpmiddel om de functie en de interacties van specifieke eiwitten zoals die in real-time aan te tonen. De methoden die in dit handschrift tonen duidelijk aan dat LTB 4 kan een snelle migratie van dendritische cellen te induceren. Deze methoden niet alleen de aspecten van de LTB 4 functie om diverse soorten cellen uit te breiden, ze laten soortgelijke methoden worden toegepast op een verscheidenheid van andere chemokinen en het testen van hun werkzaamheid als chemo…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Het onderzoek wordt ondersteund door National Institutes of Health beurzen AI-52381, CA138623 en Kentucky Lung Cancer Research Board en institutionele steun van James Graham Brown Cancer Center.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Cell lines: | ||||
| Rat Basophilic Leukomia Cell line (RBL-2H3) or HEK293 cells. | ATCC | CRL-2256 | ||
| Media: | ||||
| Delbecco’s modified Eagle’s Medium (DMEM) | Invitrogen | 11995 | ||
| Phenol red free RPMI or DMEM | Invitrogen | 11835-030 | ||
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 16000-044 | ||
| L-Glutamine (200 mM) | Invitrogen | 25030 | ||
| Penicillin-streptomycin (10000 U/mL) | Invitrogen | 15140 | ||
| Trypsin, 0.05% (1X) with EDTA 4Na, liquid | Invitrogen | 25300 | ||
| HEPES (1M) | Invitrogen | 15630 | ||
| Others: | ||||
| 35 mm sterile glass coverslip-bottomed Fluoro dishes (0.17 mm thick) (WillCo-dish) | WPI | FD35-100 | ||
| Sterile Gene Pulser Cuvette (0.4 cm electrode gap) (Bio-Rad) | Bio-Rad | 16552088 | ||
| Instruments/software: | ||||
| Gene Pulser II electroporater | Bio-Rad | |||
| TE-FM Epi-Fluorescence system attached to Nikon Inverted Microscope Eclipse TE300 | Nikon | |||
| Metamorph Software | Universal Imaging | |||
| Vertical Micro-pipette puller | Narishige International | |||
| Micro-Forge M-900 | Narishige International | |||
| Hadraulic Micromanipulator MO-188NE | Narishige International | |||
| Coarse Manual Manipulator, MN-188NE | Narishige International | |||
| cDNA constructs: | ||||
| cDNA of G-Protein coupled receptor tagged with red fluorescence protein at C-terminus (hBLT1-RFP) | Jala et al 2005 | |||
| cDNA of cytosolic protein tagged with GFP (β-arrestin1-GFP in present study). | Jala et al 2005 |
Referencias
- Wess, J. G-protein-coupled receptors: molecular mechanisms involved in receptor activation and selectivity of G-protein recognition. FASEB J. 11, 346-354 (1997).
- Gether, U. Uncovering molecular mechanisms involved in activation of G protein-coupled receptors. Endocr Rev. 21, 90-113 (2000).
- Pierce, K. L., Premont, R. T., Lefkowitz, R. J. Seven-transmembrane receptors. Nat Rev Mol Cell Biol. 3, 639-650 (2002).
- Lefkowitz, R. J. G. protein-coupled receptors. III. New roles for receptor kinases and beta-arrestins in receptor signaling and desensitization. J Biol Chem. 273, 18677-18680 (1998).
- Shenoy, S. K., Lefkowitz, R. J. Multifaceted roles of beta-arrestins in the regulation of seven-membrane-spanning receptor trafficking and signalling. Biochem J. 375, 503-515 (2003).
- . Beta-arrest or. Nature. 383, 447-450 (1996).
- Serhan, C. N., Haeggstrom, J. Z., Leslie, C. C. Lipid mediator networks in cell signaling: update and impact of cytokines. Faseb J. 10, 1147-1158 (1996).
- Tager, A. M., Luster, A. D. BLT1 and BLT2: the leukotriene B(4) receptors. Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids. 69, 123-134 (2003).
- Toda, A., Yokomizo, T., Shimizu, T. Leukotriene B4 receptors. Prostaglandins Other Lipid Mediat. 68-69, 575-585 (2002).
- Haribabu, B. Targeted disruption of the leukotriene B(4) receptor in mice reveals its role in inflammation and platelet-activating factor-induced anaphylaxis. J Exp Med. 192, 433-438 (2000).
- Subbarao, K. Role of leukotriene B4 receptors in the development of atherosclerosis: potential mechanisms. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 24, 369-375 (2004).
- Jala, V. R., Haribabu, B. Leukotrienes and atherosclerosis: new roles for old mediators. Trends Immunol. 25, 315-322 (2004).
- Heller, E. A. Inhibition of atherogenesis in BLT1-deficient mice reveals a role for LTB4 and BLT1 in smooth muscle cell recruitment. Circulation. 112, 578-586 (2005).
- Miyahara, N. Requirement for leukotriene B4 receptor 1 in allergen-induced airway hyperresponsiveness. Am J Respir Crit Care Med. 172, 161-167 (2005).
- Terawaki, K. Absence of leukotriene B4 receptor 1 confers resistance to airway hyperresponsiveness and Th2-type immune responses. J Immunol. 175, 4217-4225 (2005).
- Shao, W. H., Del Prete, A., Bock, C. B., Haribabu, B. Targeted disruption of leukotriene B4 receptors BLT1 and BLT2: a critical role for BLT1 in collagen-induced arthritis in mice. J Immunol. 176, 6254-6261 (2006).
- Kim, N. D., Chou, R. C., Seung, E., Tager, A. M., Luster, A. D. A unique requirement for the leukotriene B4 receptor BLT1 for neutrophil recruitment in inflammatory arthritis. J Exp Med. 203, 829-835 (2006).
- Jala, V. R., Shao, W. H., Haribabu, B. Phosphorylation-independent beta-arrestin translocation and internalization of leukotriene B4 receptors. J Biol Chem. 280, 4880-4887 (2005).
- Jala, V. R., Haribabu, B. Real-time analysis of G protein-coupled receptor signaling in live cells. Methods Mol Biol. 332, 159-165 (2006).
- Del Prete, A., A, . Regulation of dendritic cell migration and adaptive immune response by leukotriene B4 receptors: a role for LTB4 in up-regulation of CCR7 expression and function. Blood. 109, 626-631 (2007).
- Salogni, L. Activin A induces dendritic cell migration through the polarized release of CXC chemokine ligands 12 and 14. Blood. 113, 5848-5856 (2009).
- Boudreau, J., Koshy, S., Cummings, D., Wan, Y. Culture of myeloid dendritic cells from bone marrow precursors. J Vis Exp. , (2008).
