אלל ספציפי Gene Expression Assay כדי לבדוק את בסיס פונקציונלי של אגודות גנטי

1) תא התרבות בחירת סוגי תאים המבטאים את הגן של עניין. בחירת שורות תאים הטרוזיגוטיים הן בסיכון גרסאות ה-DNA פולימורפיזם קידוד עיבד בתוך הגן של עניין (איור 1). תרבות שורות תאים נבחרים על פי מפרט של הספק ולהכין 2 x 10 ס"מ בצלחות פטרי להפקת DNA ו-RNA, בהתאמה. כאשר התאים מגיעים 80% מפגש להתחיל את ההליך תאים יבולים ולבודד DNA ו-RNA או ביצוע ההליך המתואר להלן או באמצעות ערכות זמינים מסחרית. 2) מיצוי DNA הסר מדיה המנה, לשטוף עם PBS ולהוסיף μL את צלחת 500 של פתרון תמוגה (0.6% SDS, 100 mM NaCl, 50 מ"מ טריס, 20 mM EDTA ו – 50 מיקרוגרם / מ"ל ​​RNase A). הסלע צלחת בעדינות במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. לגרד את lysate התא לתוך צינור microcentrifuge ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. הוסף proteinase K לריכוז סופי של 100 מיקרוגרם / מ"ל ​​ו – דגירה על 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. חלץ את ה-DNA עם נפח שווה של פנול, כלורופורם pH 8, חזור, ואז לחלץ עם נפח שווה של אלכוהול כלורופורם / isoamyl. להאיץ את ה-DNA עם 1 / 10 נפח ה 3 M NaCl ו – 2.5 כרכים של 100% אתנול. השאירו על קרח דק 5 ואז לסובב בסל"ד 13,000 למשך 30 דקות ב 4 ° C. לשטוף את ה-DNA עם אתנול 70%, כדי לאפשר אוויר יבש resuspend ב μL של TE 200. לדגור על 65 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ולאחר מכן יוצאים 2 ימים בטמפרטורת החדר. חנות ב 4 מעלות צלזיוס או לטווח ארוך ב -20 ° C. 3) הפקת רנ"א הסר מדיה המנה, לשטוף עם PBS, מוסיפים 1 מ"ל של TRIzol ו דגירה של 10 דקות בטמפרטורת החדר. תאים לגרד, פיפטה כמה פעמים, להעביר בצינור microcentrifuge ו דגירה של 5 דקות. ספין דקות 10 בסל"ד 10,000 ב 4 ° C. מעבירים את supernatant בצינור טריים להוסיף 200 μL של כלורופורם. להתגעש ו ספין דקות 10 בסל"ד 10,000 ב 4 ° C. מעבירים את השלב מימית בתוך שפופרת טריים להוסיף נפח זהה של אתנול 70%. טען הפתרון 1 או 2 (בהתאם לכמות) טור ספין RNeasy ובמשך 30 שניות במהירות המרבית. מכאן בעקבות הוראה של הערכה RNeasy (Qiagen). 4) חומצות גרעין לדוגמא הכנה לכמת DNA ו-RNA ריכוז באמצעות ספקטרופוטומטר NanoDrop (Thermo Scientific). הכנת cDNA מ ng 500-1000 של רנ"א באמצעות decamers אקראי עילי III הפוך transcriptase (Invitrogen) על פי הוראות היצרן. 5) ו-PCR הרחבה Assay פריימר עיצוב שני זוגות של primers PCR עבור כל סמן ה-DNA, זוג אחד עבור הגברה DNA גנומי לבין זוג אחרים הגברה cDNA (איור 2). מקום קדימה לאחור תחל עבור cDNA הגברה ב אקסונים שונים, כדי למנוע זיהום גנטי. עיצוב תחל לקבל מוצר PCR בטווח של 100-500 אורך נ"ב. הכן 10 μL תגובת PCR כולל 0.5 U Immolase תקי (Bioline) dNTPs 0.8 מ"מ, 2 מ"מ MgCl 2, 0.2 מ 'כל אחד ו – 20 ng פריימר או של cDNA או דנ"א. Amplify כל מדגם בארבעה תגובות עצמאיות. הפעל את תגובת ה-PCR בתנאים אופטימיזציה עבור כל זוג פריימר שמירה מספר מחזור בשלב ליניארי של הגברה. הסר פריימר PCR ו dNTPs עודף ידי דוגרים המוצר PCR עם exonuclease ואני phosphatase שרימפס אלקליין (SAP) בשעה 37 ° C במשך 20 דקות. ספוט כל מוצר PCR פעמיים על צלחת 384, טוב, כך 8 מדידות יהיה זמין עבור כל דגימה. עיצוב תחל הרחבה עם תוכנת עיצוב (Sequenom) Assay כך פריימר אותו יכול לשמש עבור מוצרים PCR הן cDNA גנומי. ציין אורך תחל בטווח של 14-18 נ"ב ומערבבים הרחבה כולל שילובים של 3ddNTPs (איור 2). ביצוע ההארכה פריימר התגובה וניתוח MALDI-TOF/MS באמצעות מערכת MassARRAY (Sequenom) בהתאם להוראות היצרן. תגובה אופיינית הארכת תחל כוללים צעד החל מ 94 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות, ואחריו 40 מחזורים של 94 מעלות צלזיוס למשך 5 שניות, 52 מעלות צלזיוס למשך 5 שניות ו 72 מעלות צלזיוס למשך 5 s. הארכה המוצרים תחל מנקים עם שרף SpectroCLEAN והועברו על microarray (שבב) על ידי מנפק nanolitre SpectroPOINT. Oligonucleotides המורחבת הם לכמת ידי MALDI-TOF באמצעות ספקטרומטר מסה SpectroREADER. 6) ניתוח סטטיסטי בדוק תוצאות MALDI-TOF/MS עם התוכנה Typer MassARRAY לאיכות הכללית של הניסוי. תמצית הדו"ח Allelotyping הכולל את הנתונים אזור השיא. עבור כל קשת הפרט לחשב אתהיחס בין שטח השיא של אלל אלל 1 ו 2 (יחס אזור השיא). עבור כל דגימה cDNA לגזור אזור השיא יחס ממוצע וסטיית התקן, באמצעות הפונקציה המתאימה ב-Excel, על פני 8 מדידות. לגזור את אותו אזור מתכוון יחס שיא ברחבי 8 measurments עבור ה-DNA הגנומי. מחלקים את יחס ממוצע cDNA על ידי היחס אומר גנטי כדי להעריך את הסטייה ליחס 01:01 צפוי. 7) ניסיוני Controls כדי לשלול ממצאים ניסויים, לחזור על הניסוי לפחות שלוש פעמים. במידת האפשר, עיצוב מבחני עבור סמני דנ"א נוספים. עיצוב מספר זוגות PCR פריימר ואת primers הרחבה חישול אל חוטי שתי קדימה לאחור. בכל פעם מבחן האפשרי קווי שולטת שלילי סלולריים, כי הם הטרוזיגוטיים סמני ה-DNA, אך לא לשאת את הסיכון DNA וריאנטים הקשורים הפנוטיפ (איור 1, איור 3.) 8) נציג תוצאות דוגמה של ניתוח אלל מסוים הביטוי שמוצג באיור 3 עם דוגמאות של עקבות ספקטרומטריית מסה. האיור מציג את תוצאות ניתוח של 4-אלל מסוים תחל מוצרים הרחבה שבוצעו על 4 תבניות שונות. גרפים העליון מייצג את התוצאות שהתקבלו מניתוח של הדנ"א הגנומי של שתי שורות תאים שונות, אשר שניהם הטרוזיגוטיים פולימורפיזם קידוד עיבד. עם זאת, רק קו תא הוא הטרוזיגוטיים עבור גרסה הסיכון DNA (איור 1). גרפים התחתון מייצג את התוצאות שהתקבלו מניתוח של cDNA שנוצר משימוש שורות תאים זהים. כתוצאה חפץ ניסיוני השיא הראשון הוא תמיד גבוה יותר מאשר השיא השני אפילו בניתוח הגנומי. לכן, התוצאות מניתוח גנומית משמשים לנרמל את הנתונים cDNA. לאחר נורמליזציה, יחס אלל שונה מהותית 1 בתור תא (כאשר השיא השני מופיע נמוך יותר לעומת הספקטרום אחרים), כאשר הוא קרוב מאוד 1 בתור תא B. הנתונים מראים כי קו התא נושא גרסה ה-DNA, בשלב עם אלל נמדד השיא השני, אשר מפחית את הביטוי של הגן תחת ניתוח. קו B Cell מספק שליטה נוחה מאוד שלילי. באיור 1. קו סלולרי אסטרטגיה הבחירה. שורות תאים A ו-B הם הטרוזיגוטיים סמן קידוד עיבד (משולש) אלא רק שורת תאים הוא הטרוזיגוטיים עבור גרסה הסיכון DNA (עיגול). האלל הכחול של וריאנט את הסיכון קשורה (או עם השפעה ישירה או משום מתאם הדוק עם גרסה התפקודית בפועל) עם רמה נמוכה של שעתוק. איור 2. אלל ספציפי תחל הרחבה assay. נתון זה מראה את העבודה זרימה של הליך הניסוי שנערך עבור ה-DNA הן (מימין) תבניות cDNA (משמאל) הגנומי. PCR primers (מלבנים אפורים) נועדו להגביר פולימורפיזם קידוד הטרוזיגוטיים (משולש). כדי למנוע זיהום גנטי PCR primers לחשל רצפים להציב אקסונים שונים (אור ברים כחול) כאשר ההגברה נעשית על תבנית cDNA. המוצר PCR משמש אז לתגובת תחל הרחבה ביצע עם פריימר שלוחה כתבנית, חישול בסיס אחת ליד פולימורפיזם, ואת תערובת מתאימה של dideoxynucleotide שלושה (ddNTPs) לחסרי (ריבועים) ואחד deoxynucleotide (עיגול) להאריך את פריימר של בסיס אחד או שניים בהתאמה. הארכה המוצרים וכתוצאה מכך יש פריימר ההמונים שונים המאפשרים הפרדה וכימות ידי ספקטרומטריית MALDI-TOF המוני. כמות המוצר המתאים האלל הכחול של סמן ה-DNA הוא יחסית נמוך אלל אדום. איור 3. תוצאות assay-אלל מסוים הביטוי. הדמות להציג את התוצאות ספקטרומטריית מסה מניתוח שנערך על ה-DNA הגנומי ואת cDNA של שורת תאים קו תא B (איור 1).