الأليل محددة التعبير الجيني الفحص لفحص الأسس الفنية للجمعيات الوراثية
Summary
الجمعيات الجينية غالبا ما تظل غير المبررة على مستوى وظيفي. هذا الأسلوب يهدف إلى تقييم تأثير النمط الظاهري المرتبطة علامات وراثية على التعبير الجيني عن طريق تحليل الخلايا متخالف لالنيوكلوتايد كتب. وتتيح تقنية قياس دقيقة بواسطة مطياف الكتلة – TOF MALDI لتحديد أليل محددة تمديد التمهيدي المنتجات.
Abstract
عدد كبير من الجمعيات وراثية معقدة مع الصفات المشتركة في تزايد مستمر. ومع ذلك ، لم تكن معظم هذه الجمعيات المفهوم على المستوى الجزيئي. واحدة من آليات الوساطة تأثير المتغيرات الحمض النووي على الظواهر هو التعبير الجيني ، وهو ما ثبت أن تكون ذات أهمية خاصة لصفات معقدة 1.
هذا الأسلوب في الاختبارات السياق الخلوية تأثير تسلسل الحمض النووي محددة على التعبير الجيني. المبدأ هو لقياس الوفرة النسبية للمحاضر الناشئة عن الأليلات اثنين من الجينات ، وتحليل الخلايا التي تحمل نسخة واحدة من تسلسل الحمض النووي المرتبطة المرض (المتغيرات المخاطر) 2،3. لذا ، ينبغي أن الخلايا المستخدمة لهذا الأسلوب الوراثي تلبية شرطين أساسيين : يجب عليهم أن يكونوا متخالف سواء بالنسبة للمتغيرات المخاطر الحمض النووي DNA وعلامات ، الأشكال المتعددة الترميز عادة ، والتي يمكن تمييز النصوص على أساس أصلهم الكروموسومات (الشكل 1). المتغيرات مخاطر الحمض النووي DNA وعلامات لا حاجة الى تكرار الأليل نفسه ولكن في المرحلة (haplotypic) العلاقة بين علامات وراثية يجب أن يكون مفهوما. من المهم أيضا أن تختار أنواع الخلايا التي تعبر عن هذا الجين من الفائدة. هذا البروتوكول يشير تحديدا إلى الإجراء المعتمد لاستخراج الخلايا الليفية من الأحماض النووية ولكن هذه الطريقة تنطبق أيضا على أنواع الخلايا الأخرى بما في ذلك الخلايا الأولية.
يتم استخراج DNA و RNA من خطوط الخلية المحددة ، ويتم إنشاؤها [كدنا]. ويتم تحليل الحمض النووي و[كدنا] مع التمهيدي مقايسة الإرشاد ، ومصممة لاستهداف علامات الحمض النووي الترميز 4. ويتم التمديد لفحص التمهيدي خارج باستخدام (Sequenom) MassARRAY 5 منصة وفقا لمواصفات الشركة المصنعة. ثم يتم تحليل المنتجات تمديد التمهيدي بواسطة مصفوفة بمساعدة الليزر الامتزاز الوقت / تأين الطيران مطياف الكتلة (MALDI-TOF/MS). لأن علامات المختارة هي متخالف فإنها تولد بين قمتين على ملامح MS. وتبلغ مساحة كل ذروة يتناسب مع وفرة نص ويمكن قياس مع وظيفة من برنامج من نوع MassARRAY لتوليد نسبة أليلية (أليل 1 : أليل 2) الحساب. هو تطبيع أليلية نسبة حصلت عليها لاستخدام [كدنا] أن يقاس من الحمض النووي الجيني ، حيث من المتوقع أن نسبة أليلية أن تكون لتصحيح 01:01 التحف الفنية. علامات مع نسبة لا تختلف كثيرا أليلية تطبيع إلى 1 تشير إلى أن كمية نص المتولدة من الكروموسومات اثنين في نفس الخلية مختلفة ، مما يدل على أن الحمض النووي المتغيرات المرتبطة النمط الظاهري يكون لها تأثير على التعبير الجيني. وينبغي أن تستخدم ضوابط التجريبية لتأكيد النتائج.
Protocol
Discussion
هذه الطريقة تمكن من تقييم تأثير الأمراض المرتبطة المتغيرات الحمض النووي على التعبير الجيني عن طريق تقييم الفرق في الجسم الحي محددة أليل في مستوى النص. في هذا البروتوكول هو قياس وفرة نسبية من خلال نص TOF MALDI ، ولكن غيرها من التكنولوجيات السماح الكمي أليل محددة ، مثل TaqMan 6،7 ، يمكن استخدام. القيد الرئيسي لهذا النهج هو توافر كتب علامات الترميز. ووصف الأساليب على أساس مبدأ هنا ، ولكن الاستفادة من فئات مختلفة من الأشكال المتعددة ، وقد وصفت. في مقايسة haploChip تدابير محددة أليل التعبير باستخدام علامات يقع في حدود 1 كيلو بايت من بداية النسخي أو موقع نهاية الجين الذي سيكون حاضرا في لونين immunoprecipitated المواد المعزولة مع الأجسام المضادة المحددة لرنا بوليميريز الثاني 8. بدلا من ذلك ، يمكن استخدام intronic النيوكلوتايد عندما القالب heteronuclear RNA 9.
وصف بروتوكول معين هنا ، في تركيبة مع مقايسة haploChip ، وقد استخدم بنجاح لتحديد الجينات مرشح لعسر القراءة (القراءة أو العجز). في البداية حددت دراسة جمعية الوراثية DNA تسلسل المرتبطة عسر القراءة والذي يمتد ثلاثة جينات 10. اظهر أليل محددة التعبير الجيني في الفحص ان وجود عسر القراءة المرتبطة اختلاف الحمض النووي التعبير عن المتغيرات لوحظ واحد فقط من الجينات الثلاثة ولكن ليس ال 11 الأخرى اثنين.
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| PBS | Sigma | P-4417-100TAB | ||
| SDS | Biorad | 161-0416 | ||
| NaCl | VWR | 27788.366 | ||
| Tris | Sigma | T1503-1KG | ||
| EDTA | Sigma | E5134-500G | ||
| RNase A | Qiagen | 19101 | ||
| Proteinase K | Sigma | P2308-500MG | ||
| Phenol: chloroform | Sigma | 77617 | ||
| Chloroform | VWR | 100777C | ||
| Ethanol | Sigma | 32221-2.5L | ||
| Trizol | Invitrogen | 15596-018 | ||
| RNeasy kit | Qiagen | 74104 | ||
| SuperScript III Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18080-044 | ||
| Immolase Taq | Bioline | BIO-21048 | ||
| dNTP | Sigma | DNTP100A | ||
| Exonuclease 1 | NEB | M0293S | ||
| Shrimp Alkaline Phosphatase | GE Healthcare | E70092Z | ||
| SpectroCLEAN resin | Sequenom | 10053 | ||
| MassEXTEND ddNTP/dNTP mix | Sequenom | Varies according to assay design | ||
| MassEXTEND thermosequenase | Sequenom | 10052 | ||
| Equipment | ||||
| Chilled microcentrifuge | Eppendorf | |||
| NanoDrop Spectrophotometer | Thermo Scientific | |||
| SpectroPOINT nanolitre dispenser | Sequenom | |||
| SpectroREADER mass spectrometer | Sequenom |
Referencias
- Cookson, W., Liang, L., Abecasis, G., Moffatt, M., Lathrop, M. Mapping complex disease traits with global gene expression. Nat Rev Genet. 10, 184-194 (2009).
- Singer-Sam, J., LeBon, J. M., Dai, A., Riggs, A. D. A sensitive, quantitative assay for measurement of allele-specific transcripts differing by a single nucleotide. PCR Methods Appl. 1, 160-163 (1992).
- Yan, H., Yuan, W., Velculescu, V. E., Vogelstein, B., Kinzler, K. W. Allelic variation in human gene expression. Science. 297, 1143-11 (2002).
- Ding, C., Cantor, C. R. A high-throughput gene expression analysis technique using competitive PCR and matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight MS. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 3059-3064 (2003).
- Gabriel, S., Ziaugra, L. SNP genotyping using Sequenom MassARRAY 7K platform. Curr Protoc Hum Genet Chapter. Chapter 2 (Unit 2), 12-12 (2004).
- Lo, H. S. Allelic variation in gene expression is common in the human genome. Genome Res. 13 (8), 1855-1862 (2003).
- Liu, X. Expression-based discovery of variation in the human glutathione S-transferase M3 promoter and functional analysis in a glioma cell line using allele-specific chromatin immunoprecipitation. Cancer Res. 65, 99-104 (2005).
- Knight, J. C., Keating, B. J., Rockett, K. A., Kwiatkowski, D. P. In vivo characterization of regulatory polymorphisms by allele-specific quantification of RNA polymerase loading. Nat Genet. 33 (4), 469-475 (2003).
- Pastinen, T. A survey of genetic and epigenetic variation affecting human gene expression. Physiol Genomics. 16 (2), 184-193 (2004).
- Francks, C. A 77-kilobase region of chromosome 6p22.2 is associated with dyslexia in families from the United Kingdom and from the United States. Am J Hum Genet. 75 (6), 1046-1058 (2004).
- Paracchini, S. The chromosome 6p22 haplotype associated with dyslexia reduces the expression of KIAA0319, a novel gene involved in neuronal migration. Hum Mol Genet. 15 (10), 1659-1666 (2006).
