Het bepalen van het aantal cellen tijdens de celdeling Cultuur met de Scepter Cell Counter

1. Het belang van Cell Tellen Het tellen van cellen is een noodzakelijke, maar vervelende stap voor in vitro celkweek. Consistente cel concentraties in experimentele reproduceerbaarheid en nauwkeurigheid. Bloedcellen zijn belangrijk voor het toezicht op gezondheid van de cellen en proliferatie rate, het beoordelen van immortalisatie of transformatie, zaaien cellen voor de volgende experimenten, transfectie of infectie, en de voorbereiding van cel-gebaseerde testen. Ondanks de behoefte aan snelheid en nauwkeurigheid in cel tellen,, 71% van de 400 ondervraagde onderzoekers tellen cellen met behulp van een hemocytometer. Terwijl hemocytometry is goedkoop, het is bewerkelijk en onderworpen aan de gebruiker vooringenomenheid en misbruik, wat resulteert in onjuiste tellingen. Bronnen van fouten in hemocytometry zijn: ongelijke verdeling cel in de steekproef, te veel of te weinig cellen in het monster, subjectieve beslissingen over de vraag of een bepaalde cel binnen de gedefinieerde gebied tellen, verontreiniging van de hemocytometer, user-to-user variatie , en de variatie van hemocytometer vullen tarief. Om de verveling te verlichten verband met handmatige tellen, 29% van de onderzoekers tellen cellen met behulp van geautomatiseerde cel telinrichtingen. Echter, voor de meeste onderzoekers, de prijs verbonden aan deze grote bench-top instrumenten is een belemmering voor het gebruik ervan. De Scepter celgetalmeter is een geautomatiseerd mobiel apparaat dat de automatisering en nauwkeurigheid van de Coulter tellen bij een relatief lage kosten biedt. Het systeem maakt gebruik van de Coulter principe van impedantie-gebaseerde deeltjes detectie in een geminiaturiseerde vorm met behulp van een combinatie van analoge en digitale hardware voor detectie, signaalverwerking, data-opslag, en grafische weergave. De disposable sensor is ontworpen met een microfabricated, cel-sensing zone die discriminatie door celgrootte en het volume op sub-micron en sub-picoliter resolutie mogelijk maakt. Verbeterde met precisie vloeistof-handling kanalen en elektronica, de Scepter cel teller geeft grafisch celpopulatie statistieken als een histogram. 2. Voorbereiding van een Single-cell Suspensie voor tellen Voor het gebruik van de Scepter cel tegen te gaan, beginnen met het verdunnen van een enkele celsuspensie van cellen, in fosfaat gebufferde zoutoplossing. Een concentratie van 10,000-500,000 cellen per ml is optimaal. Breng 100 pi van de verwaterde cellen aan een 1,5 mL microfugebuis. 3. Het uitvoeren van celtellingen het gebruik van de Scepter Zet de scepter cel tegen te gaan door te drukken en houden van de te schakelen op de achterkant van het instrument en wachten op de instructies op het scherm te verschijnen. Wanneer u wordt gevraagd, sluit een sensor aan het einde van de Scepter eenheid met de elektrode sensing-paneel naar de voorkant van het instrument. Scepter sensoren bestaan ​​uit een precisie gegoten monsterkamer, met een elektronische detectie zone en geïntegreerde cel-sensing elektroden. De sensoren maken het mogelijk om celgrootte discrimineren op sub-micron resolutie en celvolume bij sub-picoliter resolutie. Consistente sensor techniek, zorgt ervoor dat gelijk monster volumes worden geteld en nauwkeurige grootte metingen worden gemaakt. Zodra de sensor is aangesloten, voert u elke stap van het tellen werkwijze volgens de instructies op het scherm als volgt: Wanneer het scherm leest "Houd de zuiger om te beginnen," op de zuiger. Het scherm zal dan lezen "onderdompelen van de sensor." Dompel de sensor in de celsuspensie oplossing en laat de zuiger naar de celsuspensie zuigen in de sensor. De zuiger fungeert als een elektrisch signaal en zal gebruik maken van het monster plus dood volume in de sensor. De snelheid of nauwkeurigheid van dompelen maakt niet uit als met pipetteren. Dit proces duurt enkele seconden. Als u klaar bent, het apparaat piept, en "geladen Sample" wordt weergegeven op het scherm. Nadat het monster is geladen in de sensor wordt opgesteld door de sensing zone celgrootte en het volume vervolgens beoordelen, door de microkanalen. Zodra 50 pi van het monster wordt geteld van de Sensor vertelt het instrument om te stoppen met tellen. Na de telling is voltooid, wordt het instrument scherm te lezen "Count Compleet. Verwijder sensor en gooi deze weg." Volg de prompt, en verwijder en gooi de sensor. Het instrument geeft vervolgens een histogram van de celgrootte of diameter op het scherm als de cel concentratie per ml. 4. Data Analysis Na de telling is voltooid en het histogram wordt weergegeven op het instrument van toepassing poorten door op de toggle knop. Selecteer de "auto gating" of het "gebruik laatste" ofwel automatisch de gate op basis van het histogram profiel, of om de poorten te gebruiken uit de vorige telling. Onafhankelijk van de selectie, kan de poorten handmatig worden verplaatst naar fine-tunen van de gegevens. Druk nogmaals op de toggle button aan de linkerkant poort te selecteren en blader naar deggle naar de poort te verplaatsen naar wens. En druk nogmaals op de tuimelschakelaar om de juiste gate te activeren en het schakelen gaat u naar de juiste gate plaats. Klik opnieuw, een nieuwe cel de concentratie, gemiddelde celvolume en de diameter wordt weergegeven. De schakelaar kan ook worden verplaatst naar beide kanten om de weergave tussen de datum wisselen, tijd, gemiddelde celgrootte, en het gemiddelde celvolume. Tot 72 histogrammen kan worden opgeslagen op het instrument zelf. Om de gegevens uploaden naar een computer, sluit het instrument via de USB-kabel-poort op het scherm. Op de PC, dubbelklikt u op de Scepter Software Application om de software vervolgens lancering op "connect" te klikken. Alle tellingen worden automatisch haven naar de software. De Scepter Application Software geeft het histogram waarin de bevolking verdeling van de cultuur in volume of diameter. Gedownloade bestanden kunnen vervolgens worden geëxporteerd naar Microsoft Excel, waar de ruwe data worden weergegeven in bakken van bepaalde cel diameters of cel volumes. 5. Representatieve resultaten Negentien verschillende cellijnen werden voorbereid voor het tellen en de theoretische uitgangspunten concentraties werden bepaald met behulp van een Coulter Counter. Deze cel suspensies werden vervolgens verder verdund tot celsuspensies verkrijgen op theoretische cel concentraties. De Scepter celgetalmeter werd vervolgens gebruikt om celconcentraties te bepalen. Figuur 1 toont vijf verdunningen die werden gemeten voor vijf representatieve cellijnen, samen met de theoretische cel concentratie. De hoge mate van lineariteit, zoals aangegeven door de R2-waarden, toont aan dat Scepter tellen is een betrouwbare methode voor de cellijnen getest, over een breed lineair bereik. De totale relatieve nauwkeurigheid van Scepter tellen is aangetoond in figuur 2, waarin de gegevens van Scepter tellen zijn vergeleken met tellingen verkregen uit Coulter tellen. Het logboek van Scepter-cel-tellingen is uitgezet tegen de log van Coulter telt, en toont aan dat, over alle geteste cellijnen, Scepter telt overeenkomen Coulter telt. Tellingen van 19 cellijnen werden uitgevoerd met behulp van een Z2 Coulter Counter, de Scepter cel toonbank, een geautomatiseerde vision-based tegen te gaan, zoals Vi-Cell of Talloze systeem en een hemocytemeter. Tellingen werden uitgevoerd volgens de instructies van de fabrikant, het gebruik van de dezelfde cel te beginnen vering en identieke verdunningen. De resultaten weergegeven in Figuur 3 tonen aan dat celconcentraties gemeten door het tellen van Scepter die nauw aansluit bij de theoretische celconcentraties met een hoge lineariteit. Het percentage variatiecoëfficiënt, of CV, werd berekend voor elke verdunning van elke cellijn voor elk telsysteem. Figuur 4 toont het gemiddelde% cv's meer dan 19 cellijnen met betrekking tot cel-concentratie en het tellen methode. Binnen het bereik, de Scepter celgetalmeter is nauwkeuriger dan visie die gebaseerd is hemocytometer tellen, het weergeven van kleinere standaarddeviaties en kleinere gemiddelde coëfficiënten van variatie. Scepter tellen is tien keer sneller dan hemocytometry en sneller dan andere geautomatiseerde tellers ook. In figuur 5, SF9, MCF7, en HEK293 cellen werden geteld met behulp van de methoden beschreven in deze video. De gemiddelde tijd die nodig is om cellen te meten concentratie werd opgenomen. Merk op dat hemocytometry was slechts een keer uitgevoerd per monster. Scepter maakt metingen op basis van celgrootte. Dus eventuele veranderingen in cellulaire morfologie kunnen worden vastgelegd in het histogram. Gezonde culturen weer een mooie klokvormige Gaussische verdeling, terwijl ongezonde cellen, lyseren, en veroorzaken een verschuiving in het histogram naar links (Figuur 6, linker paneel). Ook wanneer een bevolking van 50% dode cellen werden gemengd met 50% levende cellen, werden histogram verschuivingen ook waargenomen (Figuur 6, rechter paneel).