VE Dik Görüntüleme Drosophila Embriyolar
Summary
Burada lekeli için bir montaj protokolü<em> Drosophila</em> Mikroskopisi kullanarak kesit görüntüleme sağlayan bir dik pozisyonda embriyolar.
Abstract
Birkaç iyi bilinen morfogenetik gradyanlar ve hücresel hareketler / dorsal ventral eksen boyunca meydana<em> Drosophila</em> Embriyo. Ancak, bu süreçler görüntülemek için kullanılan güncel teknikleri biraz sınırlı. Aşağıdaki protokol, sabit ve etiketli montaj için yeni bir teknik açıklar<em> Drosophila</em> Konfokal görüntüleme ile koronal görüntülemek için embriyo. Bu yöntem, gliserin jöle montaj medya iki kat arasında embriyolar gömme oluşur ve görüntüleme jöle şeritleri dik olarak konumlandırılmış. Embriyolar sandviç için ilk adım, bir slayt üzerinde gliserin jöle ince bir yatak yapmak için. Daha sonra, embriyolar bu yüzey üzerinde dikkatle hizalanmış ve jöle ikinci bir tabaka ile kaplıdır. Ikinci kat katılaşmış sonra, jöle şeritler kesilir ve görüntüleme için dik çevrileceği. Alternatifler embriyoların mikroskop standı kullanılmak üzere türüne bağlı olarak görselleştirmek için açıklanmıştır. Dorsal-ventral eksen boyunca tüm hücreleri tek bir konfokal Z-düzlemi içinde görüntülü olduğu için, yöntem boylamasına monte embriyoların 3D rekonstrüksiyonlar ortak saçılma photobleaching veya ışık olmadan, hassas ölçüm ve floresan sinyallerin karşılaştırma sağlar.
Protocol
Discussion
Dilimleri 2 veya genellikle floresan renklendirmeler için zararlı mikrotom işleme, gömülü medya kullanımı ya dikkatli bir yandan diseksiyonu gerektirir beri Drosophila embriyoların kesit görüntüleri almak zor olabilir. Alternatif olarak, Z-Konfokal mikroskop yapılan yığınları kesit görüntülerin 3 boyutlu rekonstrüksiyon yapmak için kullanılabilir. Ancak, doğru bir 3 boyutlu rekonstrüksiyon ve photobleaching sorunlu olur, birkaç ince Konfokal dilim yapmak için zaman alıcı. Boylamasına monte edilmiş görüntüleme embriyolar, aynı zamanda, protein ya da mRNA seviyeleri 1 ölçümü amacıyla floresan sinyallerin hassas ölçümler alarak karmaşıklaştırır embriyo, daha derin bölümleri ulaşıldığında meydana gelen ışık saçılması başka endişe konusu. Hatta bir iki foton konfokal mikroskop, ışık saçılması hala sınırlı olmak üzere en iyi örnek şeffaflık için montaj medya seçimi yapar embriyo, ortasında sarısı malzeme opaklık nedeniyle bir konudur.
Bu sorunları aşmak için, dikey konumlandırma embriyoların "End" görüntüleme adı verilen yeni bir tekniği son 4 canlı ve sabit örnekleri görüntü için geliştirilmiştir . Bu çalışmada, biz yerinde sondalar 3 birden fazla lekeli herhangi bir boyut ve şekil sabit embriyolar veya dokular basit bir hazırlık ve görselleştirme sağlayan dikey olarak monte edilen embriyolar için yeni bir protokol geliştirmiştir. Bizim yöntemi jelatinimsi bir tutarlılık içinde uyumlu embriyoların kaplamak için kullanılır montaj medya kullanılarak oluşur. Konfokal mikroskop her türlü görüntüleme önce gömülü embriyoları içeren bu montaj medya kesme taş blokların dik olarak konumlandırılmış olabilir.
Embriyoların jöle içine gömme ve dikey olarak konumlandırma, embriyonun dorsal-ventral eksen boyunca hücreler aynı anda sunulduğu mikroskopisi kullanılarak yatay kesitler almak mümkün. Bu ışık saçılması ve boylamasına monte edilmiş embriyolar geleneksel Z-yığın yeniden yapılanma oluşur floresan boyaların photobleaching artık ortadan kalkar sorunları beri kantifikasyon amaçlar için önemli bir gelişme. Dorsal-ventral zıt pozisyonlarda bulunan hücreler aynı anda ve aynı konfokal Z-pozisyon imaged Böylece, dorsal-ventral eksen boyunca gen ekspresyonu veya protein düzeylerinin ölçümü, doğru. Buna ek olarak, açıklanan yöntem bize DV 6 eksen boyunca farklı pozisyonlarda hücreleri görselleştirmek için karmaşık hesaplama unrolling yöntemleri kullanmadan, 3-D bir embriyonun dorsal-ventral eksen boyunca tam bir 2-D görüntü elde etmesini sağlar.
Bazı kritik adımlar, iki tabaka jöle arasında bölünmüş önlemek için, embriyolar hizaladıktan sonra aşırı gliserol kaldırarak içerir. Ancak, örnek çok susuz ise, elde edilen görüntü şekilsiz olabilir ve yanlış morfoloji var. Buna ek olarak, embriyonun çevresindeki jöle orta yerine düz bir açıyla kesilmiş ise, ortaya çıkan görüntü, 90 derece dışında bir açıyla embriyoların yanlış bir konumlandırma şekli nedeniyle, daha yuvarlak ve daha fazla yumurta görünebilir. Son olarak, jöle, ön / arka ucunda embriyonun yeterince yakından kesmek değilse, amacı, çalışma mesafesi esas jöle ve embriyo içine odaklanmak için kullanılır, çünkü uygun bir görüntü elde etmek mümkün değildir.
Önemli bir adım daha görüntüleme geç gastrulating embriyo hizalayarak önce dikkatlice kapsamında ilgi aşamaları sıralamak için zaman gerekli olabilir. Genellikle uzunlamasına bir pozisyonda en kolay kabul edilebilir morfolojik özelliklerine göre, embriyolar sahnelenir.
Bu yöntem ile yapılabilir alternatif değişiklikler arasında, bir anti-solmaya reaktifi (örneğin, p-Phenylenediamine'nin veya PPD), floresan boya photobleaching karşı korunmasına yardımcı, jöle, ikinci katmanı içine dahil etmektir.
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar Deborah Harris ve Danielle MacKay özellikle borçlu. Bu iş için destek ve CWRU Sanat ve Sosyal Bilimler Fakültesi Biyoloji Bölümü tarafından sağlanan ve biyolojik bilimler alanında lisans eğitimi desteklemek için HHMI hibe numarası 52005866.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Glycerin Jelly mounting media | Electron Microscopy Sciences Company | 17998-10 | Contains low concentration of phenol as preservative and should be used in hood or in well ventilated area. Recipe for making your own media is described in Zander, 1997. | |
| Zeiss LSM 700 Confocal | Zeiss | The following objectives were used: Plan-Apo 20x 0.8 M27 (WD 0.55mm); EC Plan-Neofluar 40x 1.3 oil (WD 0.21mm); LD Plan-Neofluar 0.6 Korr 40X (WD 2.9mm). | ||
| Phosphate buffered saline with 0.1% Tween 20 (PBT) | ||||
| Glass microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-7 | ||
| Glass cover slips | Electron Microscopy Sciences | 72204-02 | Size 1 ½ (specific for the objectives used in this work). | |
| Glass cover slips (for making supports) | Fisherfinest | 12-544-10 | Use four coverslips glued with superglue. | |
| Dissection microscope | M5 Wild Heerbrugg Wild Makroskop | M420 | ||
| Razor blade | Steel back single edge industrial blades | |||
| Spatula | Fisher | 21-401-10 | ||
| Hypodermic needles | Fisher | 1482610 | 26 Gauge | |
| Pipettes | Labnet |
Referencias
- Ay, A., Fakhouri, W. D., Chiu, C., Arnosti, D. N. Image processing and analysis for quantifying gene expression from early Drosophila embryos. Tissue Engineering. 14, 1517-1526 (2008).
- Grβhans, J., Wieschaus, E. A genetic link between morphogenesis and cell division during formation of the ventral furrow in Drosophila. Cell. 101, 523-531 (2000).
- Kosman, D., Mizutani, C. M., Lemons, D., Cox, W. G., McGinnis, W., Bier, E. Multiplex detection of RNA expression in Drosophila embryos. Science. 305, 846-846 (2004).
- Witzberger, M. M., Fitzpatrick, J. A. J., Crowley, J. C., Minden, J. S. End-on imaging: a new perspective on dorsoventral development in Drosophila embryos. Developmental Dynamics. 237, 3252-3259 (2008).
- Zander, R. H. On mounting delicate bryophytes in glycerol. The Bryologist. 100, 380-382 (1997).
- Liberman, L. M., Reeves, G. T., Stathopoulos, A. Quantitative imaging of the Dorsal nuclear gradient reveals limitations to threshold-dependent patterning in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (52), 22317-2222 (2009).
