הדור של RNA / DNA כלאיים ב-DNA הגנום על ידי טרנספורמציה באמצעות RNA המכיל oligonucleotides

רציונל ניצול השימוש Thermo Scientific Dharmacon oligos, 50 עד 80 מרס, כאן אנו מציגים הליך, המבוסס על assay גן תיקון, שבו oligos יכולים להעביר מידע גנטי הדנ"א הגנומי של תאים שמרים, חישול הבאים ל-DNA היעד כרומוזומליות. מיקוד מוצלח ידי oligos הוא הבקיע על ידי הופעתו של מושבות שמרים הצגת הפנוטיפ הצפוי. אם הנדסה גנטית הרצוי מתבצעת בתוך אחד או יותר ribonucleotides שולבו ברצף אוליגו, את המידע הגנטי זורם ישירות מתוך מערכת RNA ל-DNA היעד כרומוזומליות, ובכך, RNA / DNA צורות כלאיים ברמת כרומוזומליות במהלך תהליך המיקוד. Ribonucleotide / s של המדעית Thermo Dharmacon RNA המכיל אוליגו יכול לשמש כתבנית עבור גן מיקוד באמצעות סינתזה תיקון דנ"א או יכול להיות מוטבע לתוך ה-DNA ואת לשמש כתבנית במהלך שכפול הדנ"א. בניסויים אלו אנו משתמשים בשמרים / Saccharomyces cerevisiae / מערכת מודל אוקריוטים, אולם גישה דומה יכול להיות מיושם גם באורגניזמים אחרים או סוגי תאים. בסרטון הזה, אנו משתמשים המדעית Thermo Dharmacon אוליגו נועד עם הומולוגיה ל מוקד שמרים היעד גנומי אחד המכיל ribonucleotide באמצע לתקן מוטציה בגן היעד. לאחר המהפך עם RNA המכיל אוליגו, שאנו רואים את התיקון של האתר מכוון לתדר מסוים, אשר מציין כי מערכת RNA של אוליגו יכול להיות משולב בתוך ה-DNA כרומוזומלי והוא לשמש כתבנית לסינתזה של DNA במהלך שכפול הדנ"א. המידע הגנטי נישא בתוך מערכת RNA מועבר ביציבות לדורות הבאים לתא. כאן אנו מתארים את השלבים של שינוי תא שמרים ידי המדעית Thermo Dharmacon RNA המכיל אוליגו ועל הגישה לאתר את המידע RNA בהעברת לתוך הדנ"א בכרומוזומים. א עיצוב של אוליגו RNA המכיל השתמשו בניסוי זה עיצבנו אוליגו RNA המכיל לתקן פגם גנטי בשמרים ס cerevisiae הדנ"א בכרומוזומים על מוקד trp5. זן שמרים להשתמש בפרוטוקול מכיל את הגן המוטנטי trp5 עם המחיקה של שתי בסיס אחד מוטציה שטויות (איור 1A). זן שמרים כזו היא מוטציה auxotrophic טריפטופן ואינו טופס מושבות על התקשורת ללא טריפטופן. רצף הדנ"א של הגן TRP5 זמין בכתובת במאגר Saccharomyces הגנום (http://www.yeastgenome.org/). Thermo Scientific Dharmacon RNA המכיל אוליגו להשתמש בפרוטוקול זה הוא 65-mer עם הכניסה 2-בסיס ה-DNA, שנועדו לתקן את המחיקה מוטציה אחת ribonucleotide שנועדה לתקן את המוטציה שטויות של האלל trp5 (איור 1A). רצף של אוליגו נועד כדלקמן: 5'-AAAAGGGTTTTGATGAAGCTGTCG-CG-GATCCCACATTCTG-RG-GAAGACTTCAAATCCTTGTATTCT. אוליגו זה מסונתז על ידי Thermo Scientific Dharmacon (Lafayette, CO) בקנה מידה 200 ננומטר, והיא desalted, deprotected בשימוש ללא טיהור PAGE. ב הכנת אוליגו RNA המכיל עבור טרנספורמציה שמרים (שונה מן Storici et al. 2007 1) נגב חומרים אשר ישמשו לצורך הניסוי כולל אוליגו צינורות, טפטפות, מערבולת, מתלים, אזור הניסוי וכפפות משוחק על ידי החוקר עם פתרון טיהור RNase להסיר פוטנציאל זיהום RNase לפני הכל מתחיל. השתמש RNase ללא מים, ריאגנטים כימיים, צינורות טיפים פיפטה בצעדים כל. כל צעד בניסוי הזה צריך להיות RNase חינם. Resuspend המדעית Thermo Dharmacon RNA המכיל אוליגו קיבלו מהחברה עד 250 pmoles / פתרון מניות μl מים RNase-חופשית מערבולת במרץ לפזר את גלולה. חנות ב -80 ° C. מיד לפני השינוי, ההפשרה אוליגו RNA המכיל על קרח לדלל עד 50 pmoles / μl מים RNase-חופשית RNase ללא צינורות. כל שינוי דורש 1 nmole של RNA המכיל oligos. לפגל כמות נבחר של RNA המכיל oligos על בלוק 100 מעלות צלזיוס חום 2 דקות כדי לחסל מבנים משניים של oligos. מיד לאחר denaturation במקום צינור על הקרח. שמור על הקרח עד השינוי. כפי בקרה בניסוי ה-DNA רק מקבילה אוליגו משמש. אוליגו זה מופשר מ -20 ° C ו מוכן לטרנספורמציה כמו RNA המכיל אוליגו, כמתואר לעיל. ג טרנספורמציה של תאים שמרים באמצעות RNA המכיל אוליגו לחסן 5 מ"ל של מדיום נוזל עשיר YPD עם trp5 תאים שמרים מוטנטים ולצמוח בקצב של 30 ° C במשך הלילה (ראה חומרים). העברת 1.5 מ"ל של תרבות הלילה לתוך 50 מ"ל של מדיום נוזלי YPD. דגירה תאים של 30 ° C שייקר (225 סל"ד) עבור 4H. הכן פתרון 1 פתרון 2 IMMediately לפני הטרנספורמציה RNase ללא צינורות (ראה חומרים). מעבירים את התרבות התאים צינור 50 RNase ללא מ"ל ו – ספין ב 3000 סל"ד, המקביל ל 1562 גרם, 2 דקות. גלולה של משקעים התא הוא כ. 0.3 ס"מ 3. הסרת תאים supernatant ולשטוף עם 50 מ"ל מים RNase-חופשית ספין בסל"ד 3000 דקות 2. חזור על שלב 6 במשך 5 פעמים כדי להיפטר המדיום תרבות RNases כי יכול להיות נוכח המדיום כמה שיותר. הסרת תאים supernatant ו resuspend ב 5 מ"ל של פתרון 1 ו ספין בסל"ד 3000 דקות 2. הסרת תאים supernatant ו resuspend ב μl 250 הפתרון 1. זו כמות של תאים מספיקה 7-8 טרנספורמציות. 50 Aliquot μl של ההשעיה תא RNase ללא צינורות microcentrifuge, להוסיף 20 μl של רנ"א המכילים פתרון אוליגו עובד (1 nmole), או 20 μl של פתרון אוליגו-DNA רק עובד (1 nmole), או 20 μl של מים סטריליים עם אוליגו אין שליטה שלילית. ואז להוסיף 300 μl של פתרון 2 לתגובת כל שינוי. אין צורך להוסיף זרע DNA סלמון בתהליך של שינוי, כמו מעשה oligos כנשא עצמם. וורטקס במרץ לערבב מרכיבים homogenously. דגירה התגובות שינוי ב 30 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות בתוך שייקר. מחממים זעזוע 42 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. ספין למטה תאים ב 5000 סל"ד, המקביל ל g 2236, 4 דקות. הסרת תאים supernatant ו resuspend ב 100 μl של מים סטריליים. קח aliquot של השעיה זו התא לדלל אותו עם מים סטריליים על ידי קיפול 100,000 תאים בצלחת על צלחת אחת YPD באמצעות כ. 15 חרוזי זכוכית סטרילית לדגור על 30 מעלות צלזיוס למשך 2 ימים. פלייט כל התאים resuspended מתגובה כל שינוי על צלחת פטרי אחד בינוני סינתטי מוצק שלם בלי טריפטופן (SC-TRP) באמצעות כ. 15 חרוזי זכוכית סטרילית לדגור על 30 מעלות צלזיוס במשך 4-5 ימים (איור 2). ד ניתוח תיקון ג'ין ידי אוליגו המכיל את הרנ"א ספירת מושבות גדלו על המדיום סלקטיבית (איור 2), כמו גם על מדיום YPD לחשב את תדירות תיקון הגן על הרנ"א המכיל אוליגו, ה-DNA בלבד אוליגו ועל השליטה ללא אוליגו. השווה את מספר המתקבלים. שיעור חזרה ספונטנית של trp5 אללים עם שתי בסיס מחיקות ואת מוטציה שטויות הוא פחות מ 10-9 ב זן שמרים בשימוש, ובכך אנו מצפים ללא היווצרות מושבות על המדיום סלקטיבית כאשר אין oligos מתווספים התאים. Streak את מספר אקראי הרים מושבות transformant על מדיום YPD להשיג מבודד מושבה אחת. חכו יומיים לצמיחה המושבה, ואז לקחת כמה (לפחות 5) מושבות אחד ולעשות תיקונים על YPD ועל המדיום סלקטיבית. עיצוב זוג primers כדי להגביר את האזור (250-1,000 נ"ב) ממוקד על ידי אוליגו RNA-המכילה את המושבה על ידי ה-PCR (איור 1B). הליך המושבה PCR הוא כדלקמן (שונה מן Storici ו רזניק, 2006 2). תאים Resuspend (כ 1 mm3) שנלקחו טלאים בודדים 50 μl מים להוסיף 1 יחידת lyticase. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות, ואחריו הדגירה בתוך גוש חום של 100 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות כדי לשבור את התאים לשחרר את ה-DNA הגנומי של פתרון. תנאי ה-PCR: תגובת PCR כולל 10 μl של הפתרון resuspension תא, 50 pmoles כל primers קדימה הפוכה, 1 μl של 10 dNTPs מ"מ, 1 יחידה של פולימראז תקי, 5 μl של חיץ 10x ו מותאם עם מים סטריליים כדי נפח סופי של μl 50. תוכנית ה-PCR 3 דקות ב 95 מעלות צלזיוס, 30 מחזורים של 30 שניות על 95 ° C, 30 זה ב 55 ° C, ו – 1 דקות ב 72 מעלות צלזיוס; זמן הארכה הסופית של 7 דק 'ב 72 ° C, ואז דגימות נשמרים 4 ° C. הארכת זמן 1 דקות / kb ההנחה היא על התגובה הזו. בעקבות ה-PCR, דגימות מנוהלות על ג'ל agarose 1% או 2% (בהתאם לגודל הצפוי של המוצר PCR) לצורך השגחה של המוצר PCR (איור 3). אם המידע הגנטי מועבר על ידי אוליגו RNA המכיל יוצר האתר מגבלה חדשה באזור גנומי שמרים היעד (איור 1B), ניתן לבדוק את הנכונות של העברת מידע על ידי לעכל את מוצר ה-PCR עם אנזים ההגבלה המתאים. אם אין הגבלה באתר נוצר על ידי אוליגו המכיל את הרנ"א, עבור לשלב 6. תקציר ה-PCR מוצרים באמצעות אנזים הגבלה ספציפית. התגובה העיכול כוללת 6 μl של מוצר ה-PCR, חיץ, BSA (לא יכול להיות צורך אנזימים מסוימים, לראות הדרכה האנזים בשימוש), 0.5 μl של אנזים הגבלה, מים סטריליים כדי μl 15. דוגמאות מודגרת עבור h 1 בטמפרטורה ספציפית עבור האנזים בשימוש. הפעל מדגם מעוכלים יחד עם דגימות מתעכל באותה שורה של 2% agarose ג'ל לצפות הנדסה גנטית הועבר בy בדרכי RNA של אוליגו המכיל את הרנ"א (איור 3). לטהר מוצרים PCR באמצעות ערכת טיהור PCR ולהכין אותם רצפי DNA. שלח דגימות עבור סידור עם primers אותה משמש כדי להגביר את המוצר. ניתוח רצפי DNA התוצאות באמצעות תוכנה המאפשרת יישור רצפים מרובים עם רצף התייחסות נבחר (איור 4). E. הטיפול אלקליות של אוליגו המכיל את הרנ"א (איור 5) עבור כל תגובה, להוסיף 1 nmole (4 μl של 250 pmoles / פתרון מניות μl) של אוליגו המכיל את הרנ"א, או ה-DNA אוליגו לתוך צינור 1.5 מ"ל. הוסף 4 μl של 1 M NaOH עבור הידרוליזה, או לחילופין להוסיף 4 μl H 2 O כביקורת שלילית, דגירה על 65 מעלות צלזיוס באמבט מים 1 ח ואז לעבור לאמבט מים וקרח. לנטרל עם 2 μl של 1.2 M HCl, 4 μl של μl טריס M-HCl, 1 ו -4 של H 2 O, או לחילופין 6 μl של H 2 O ו – 4 μl של טריס 1 M-HCl לבקרה שלילית. שמור על הקרח עד השינוי. באיור 1. תרשים סכמטי של הגן הפגום trp5 של האלל TRP5 המתוקן על ידי RNA המכיל אוליגו.) הגן המוטנטי trp5 מכיל מחיקה של 2 הבסיס (משולש שחור) 1-שטות בסיס מוטציה (כוכבית). חד גדיל RNA המכיל אוליגו עם הכניסה 2-הבסיס (לולאה כחול) 1-RNA בסיס החלפה (מלבן אדום) יצירת Van91 אני אנזים הגבלה האתר (המוצג על ידי המסגרת) הופכת שמרים תאים כדי לתקן את הפגמים הגנטיים הגן trp5. ב) אחרי הגן TRP5 לתיקון על ידי אוליגו המכיל את הרנ"א (בסיסים תיקן מצוינים כמו מלבנים כחולים), האתר אני Van91 שנוצר לתוך הגן TRP5. שבר bp 278 כולל רק אתר אחד Van91 אני הגבלה בגן TRP5 היא PCR מוגבר על ידי זוג primers (P1 ו-P2). נ"ב 177 ו – 101 נ"ב שברי שנוצר לאחר עיכול של P1 ו-P2 מוצר ה-PCR על ידי Van91 אני מוצגים גם. איור 2. התוצאה טרנספורמציה עם RNA המכיל אוליגו.) תאים שמרים הפכה ללא אוליגו לא צורה שהיא על המושבה בינוני SC-TRP, ראה הצלחות AB. ב) צלחות CG מושבות שמרים להראות גוברת על SC-TRP אחרי תאים הופכים עם nmole 1 של ה-RNA המכיל אוליגו. ג) צלחות hl מושבות שמרים להראות גוברת על SC-TRP אחרי תאים הופכים עם nmole 1 של ה-DNA בלבד המקבילה אוליגו שליטה. איור 3. איתור של העברת המידע הגנטי של RNA המכיל אוליגו ל-DNA שמרים כרומוזומליות ידי עיכול הגבלה של המוצר PCR הגברה האזור הגנומי ממוקדות. 2% ג'ל אלקטרופורזה agarose של דגימות ה-PCR מוגבר על ידי P1 ו-P2 ו מעוכל עם אנזים אני Van91 הגבלה. Lanes 1, 8 ו -15, סולם הדנ"א עם בגדלים של 100, 200, 300, 400 ו – 500 נ"ב הצביעו מצד שמאל; מסלול 2, מוצר ה-PCR של מוקד trp5 מוגבר מ-DNA הגנומי של זן trp5 מוטציה; מסלול 3, ה-PCR מוצר מוגבר של הדנ"א הגנומי נגזר מושבה trp + ממוקדות על ידי ה-DNA רק אוליגו; נתיב 4-7, מוצרי PCR מוגבר של הדנ"א הגנומי נגזר trp + מושבות ממוקד על ידי RNA המכיל אוליגו; נתיב 9-14, Van91 אני העיכול הגבלה המוצרים PCR מ נתיבים 2-7. נוכחות של להקות נימול PCR המוצר נתיבים 10-14 יכולה להיות מוסברת על ידי עיכול חלקי על ידי Van91 אני בבית מוקד TRP5 (CCACATTCTGG). בהתחשב בכך אתר חיתוך Van91 אני (CCANNNN NTGG) יכולים להיות רצפים מרובים, אתר שנוצר TRP5 לא יכול להיות היעד האופטימלי ביותר עבור האנזים. למעשה, בעקבות רצף ה-DNA של כל המוצרים לעיל PCR נזהה אין שינויים נוספים מעבר לאלו הנישאים על ידי oligos (ראה איור 4). נ"ב 278 הלהקה PCR מוגבר על ידי P1 ו-P2 primers ואת המוצר להקות לעיכול על ידי Van91 אני של 177 נ"ב ו -101 נ"ב מוצגים ע"י החצים בצד ימין. איור 4. תוצאות ה-DNA רצף מראה תיקון הגן על ידי RNA המכיל אוליגו. Electropherogram) DNA של האזור הגנומי ממוקד על ידי RNA המכיל אוליגו. G ברצף ה-DNA (כחול התאגרף) נובע RG על RNA המכיל אוליגו. כמו כן הוא התאגרף הכניסה של בסיסים CG. סידור תוצאות מכל מוצרים אחרים PCR גם ברור כמו זה, עם אותות ניאון הרבה מעל ברקע. ב) רצפים של האזור TRP5 של + trp transformants ממוקד על ידי ה-DNA רק אוליגו (T1) ו-RNA המכיל אוליגו (T2-T5) להתאים ברצף הקונצנזוס על העליונה והם בהשוואה לזה של trp5 תאים מוטנטים לפני המיקוד על ידי oligos (DNA הגנום, אדום מוצל). תיקון RNA המכיל אוליגו בתחתית יש שני בסיס ההכנסה דנ"א חד בסיס (G) החלפה RNA מסומן באדום. האזורים התאגרף בכחול עם גוון צהוב להראות כי RNA המכיל אוליגו, כמו גם את ה-DNA רק אוליגו דווקא לתקן את המוטציה למחיקה מוטציה שטויות בכל הדגימות שנבדקו. קווים מקווקווים לסמן את המיקום של הרצף אוליגו RNA המכיל. אנא לחץ כאן כדי לראות גרסה גדולה יותר של הדמות 4. איור 5. טיפול מונע אלקליות תיקון הגן על ידי RNA המכיל אוליגו. תדירות השינוי של אוליגו המכיל את הרנ"א (R) מוצג בשורת אדום כי על ידי ה-DNA רק אוליגו (D) מוצגת הסורגים הכחולים. ברים שגיאה מייצגים את שגיאת התקן של הממוצע עבור 3 טרנספורמציות עצמאי אוליגו כל אחד. ה-DNA בלבד אוליגו מציג תדר ללא שינוי דומה, עם טיפול NaOH. אחרת, תדירות השינוי של אוליגו RNA המכיל טיפות לטיפול הבא עם 0 NaOH. לכן, הכנה עם אוליגו המכיל את הרנ"א אינו מזוהם עם אוליגו-DNA בלבד, ובכך, תדירות השינוי שנצפה הוא ספציפי ל-RNA המכיל אוליגו.