جيل من الحمض النووي الريبي / الحمض النووي DNA في الجينوم الهجائن التي تحول باستخدام الحمض النووي الريبي التي تحتوي على [أليغنوكليوتيد]
Summary
هذا العمل يوضح كيفية تكوين الحمض النووي الريبي الهجين / الحمض النووي على مستوى الكروموسومات وتكشف عن نقل المعلومات الوراثية من الحمض النووي الريبي لالجيني في خلايا الخميرة.
Abstract
البوليمرات الاصطناعية قصيرة الحمض النووي ، [أليغنوكليوتيد] (oligos) ، هي أكثر الأدوات الفنية وعلى نطاق واسع في علم الأحياء الجزيئية. يمكن أن تنتج Oligos لاحتواء أي الحمض النووي الريبي أو التسلسل المطلوب ، ويمكن أن تكون على استعداد لتشمل طائفة واسعة من التعديلات الأساسية والسكر. وعلاوة على ذلك ، يمكن أن تكون مصممة لتقليد oligos محددة التعديلات الحمض النووي ، وبالتالي ، يمكن أن تكون بمثابة أدوات مهمة للتحقيق في آثار الحمض النووي من التلف وآليات الإصلاح. وجدنا أن الحرارية العلمية التي تحتوي على الحمض النووي الريبي Dharmacon oligos بطول يتراوح بين 50 و 80 النيوكليوتيدات يمكن مناسبة بشكل خاص للدراسة ، في الوظائف ، والمجراة ونتائج الحمض النووي الريبي الكروموسومات / الهجينة من الحمض النووي وribonucleotides المضمنة في الحمض النووي. يمكن RNA / DNA الهجينة شكل بسهولة خلال إصلاح الحمض النووي ، والنسخ والنسخ ، ومع ذلك ، فإن القليل جدا هو المعروف عن الاستقرار من الحمض النووي الريبي / الحمض النووي في الخلايا الهجينة وإلى أي مدى يمكن أن تؤثر هذه الهجينة سلامة الوراثية للخلايا. المحتوية على الحمض النووي الريبي oligos ، وبالتالي ، تمثل ناقلات مثالية لإدخال الحمض النووي في الكروموزومات ribonucleotides وتوليد RNA / DNA الهجينة طول اختيار وتكوين قاعدة. هنا نقدم بروتوكول لدمج ribonucleotides في جينوم الخميرة نموذج النظام حقيقية النواة / السكيراء الجعوية /. حتى الآن ، استخدمت مختبرنا الحرارية العلمية التي تحتوي على الحمض النووي الريبي Dharmacon oligos لتوليد RNA / DNA الهجينة على مستوى الكروموسومات في الخلية أنظمة مختلفة ، من البكتيريا إلى الخلايا البشرية.
Protocol
Discussion
تم اكتشاف حقيقة أن الحمض النووي الريبي يمكن نقل المعلومات الوراثية DNA الجينومية مباشرة إلى الخلايا في الاستفادة من استخدام الحمض النووي الريبي oligos المحتوية الاصطناعية (oligos Dharmacon توليفها) 1. وكان هذا دليل على مبدأ أن الخلايا يمكن استخدامها التي تحتوي على جزيئات الحمض النووي الريبي أو تسلسل الحمض النووي الريبي فقط كقوالب لتخليق الحمض النووي. استخدام الحمض النووي الريبي التي تحتوي على oligos لم يؤد فقط إلى المظاهرة التي يمكن نقل المعلومات الوراثية من الحمض النووي الريبي لمباشرة الحمض النووي الجيني دون الحاجة لعكس كتب الحمض النووي نسخة وسيطة ، ولكن أيضا لإثبات أنه يمكن استخدام RNA كقالب مثلي في إصلاح الحمض النووي من التلف من 1،3. يمكن جعل oligos من الحمض النووي الريبي فقط أو تحتوي على مجرد ريبونوكليوتيد احد مضمن في تسلسل الحمض النووي ، كما في المثال قدمنا هنا. والمحتوية على الحمض النووي الريبي بنسبة ضئيلة واحد ريبونوكليوتيد جزءا لا يتجزأ من تصميم لتصحيح طفرة هراء في أليل trp5 معيبة الجيني. وكشفت عن نقل المعلومات الوراثية من الحمض النووي لريبونوكليوتيد الجينومية عن تغيير في النمط الظاهري (الخلية تنمو على المدى المتوسط تفتقر التربتوفان) من الخلايا المستهدفة. ويقاس تردد تصحيح الجينات التي تم الحصول عليها مع جزئية تحتوي على الحمض النووي الريبي ، وذلك بالمقارنة مع من الحمض النووي فقط السيطرة بنسبة ضئيلة. قبل تنفيذ هذا الاختبار تصحيح الجينات في الخلية خلفيات مختلفة ، حيث أننا تحور جينات الخميرة مختلفة ، يمكننا الكشف عن أي عامل / ثانية تؤثر على وجه التحديد استهداف oligos المحتوية على الحمض النووي الريبي. وبالتالي ، لا يمكننا الكشف عن آليات كيفية خلايا تنظيم استقرار RNA / DNA الهجينة. ببساطة عن طريق تصميم أنواع مختلفة من الحمض النووي الريبي oligos المحتوية يمكننا تحديد احتمال لالمسالك RNA خاص ليكون بمثابة القالب في تعديل الحمض النووي ويمكننا تحديد تسلسل الحمض النووي الريبي استقرار محددة المضمنة في الحمض النووي. وعلاوة على ذلك ، يمكننا تحديد ما هي المفضلة في الجسم الحي لعوامل ركائز التفاعل مع الحمض النووي الريبي / الهجينة الحمض النووي.
في حين أجريت دراسات عدة في المختبر ، وذلك باستخدام الحمض النووي الريبي أساسا قصيرة تحتوي على oligos ، لتوصيف وظيفة من العوامل التي يمكن التعرف على الحمض النووي الريبي في مختلطة مع الحمض النووي ، مثل الانزيمات H ريبونوكلياز 4 ، في وظائف الجسم الحي من H فضلا RNases كهوية من البروتينات الأخرى التي يمكن أن تؤثر على الحمض النووي الريبي / DNA الاستقرار الهجينة لا تزال مجهولة في معظمها. إمكانية الاستفادة من الحمض النووي الريبي التي تحتوي على oligos بطول كبيرة (50 إلى 80 السائدة) وجودة أفضل (مثل الحمض النووي الريبي oligos المحتوية الحرارية العلمية Dharmacon) قد يفتح الطريق لدراسة طائفة واسعة من العمليات الجزيئية مباشرة في الجسم الحي في خلايا الفائدة. كما هو مبين في هذا التحول ، والفيديو باستخدام الحمض النووي الريبي التي تحتوي على oligos يتطلب أساسا سوى بضع خطوات إضافية بالمقارنة مع التحول باستخدام جزيئات الحمض النووي ، لمنع تدهور بواسطة RNases. وبالتالي ، يمكن تطبيق التحويل باستخدام الحمض النووي الريبي التي تحتوي على oligos لا يقتصر على نظام الخميرة ، ولكن إلى أي نوع من الخلايا أو الكائن الحي حيث تحول بواسطة الحمض النووي oligos متمكنا.
في الختام ، واستهداف الخلايا التي تحتوي على الحمض النووي الريبي oligos يتيح الفرصة لتوليد RNA / DNA الهجينة وribonucleotides المضمنة في الحمض النووي في الجسم الحي في الخلايا. الاستقرار والوظيفة وعواقب هذه في الجسم الحي ولدت رنا / يمكن تحليل الحمض النووي الهجينة ، وتميزت ، من المحتمل الكشف عن آليات غير معروف من إصلاح الحمض النووي والكشف عن استراتيجيات جديدة لاستهداف الجينات.
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من جانب التحالف لمكافحة السرطان جورجيا المنح R9028.
Materials
A. Transformation reagents and media (modified from Storici and Resnick, 2006
- YPD (Yeast Peptone Dextrose): For 1 L, 10 g yeast extract, 20 g soy peptone, 20 g dextrose. Add 15 g agar to make YPD solid media. Autoclave before use. Store at room temperature.
- Solution 1: 0.1 M of lithium acetate. Prepare immediately before transformation. Solution 1 is a working solution, thus it is prepared directly from the powder. No stock solution is made. Keep at room temperature. LiAc increases the yeast cell wall permeability to DNA.
- Solution 2: 0.1 M of lithium acetate and 50 % of polyethylene glycol 4000. Also solution 2 is a working solution and it is made directly from the powder. No stock solution is prepared. Keep at room temperature. PEG deposits oligos onto yeast cells.
- RNA-containing oligos (Thermo Scientific Dharmacon), 50-80-mers, desalted, deprotected and non-purified. Resuspend to 250 pmoles/μl. Store at -80°C.
- DNA-only oligos, 50-80-mers, desalted and non-purified. Resuspend to 50 pmoles/μl. Store at -20°C.
- SC-Trp (Synthetic complete media lacking tryptophan) solid media.
- 0.5 cm diameter glass beads, sterilized by autoclaving.
- RNase-off: RNase decontamination solution.
- DNase/RNase-free, sterile centrifuge tubes.
- DNase/RNase-free, sterile conical tubes.
- DNase/RNase-free, sterile aerosol pipette tips with ZAP: 1-200 ml, 100-1000 ml.
B. Colony PCR materials.
- DNA primers, desalted and non-purified. Dissolve in sterile water to 50 pmoles/μl. Store at -20°C.
- Taq DNA polymerase, buffer, dNTPs.
- PCR tubes.
C. PCR purification.
- PCR purification kit.
D. Gel Electrophoresis.
- Agarose.
- 1 x TBE running buffer (45 mM Tris-borate and 1 mM ethylenediamine tetraacetate) diluted from 10x TBE.
- Prestained molecular weight marker.
- DNA loading dye.
E. Restriction digestion.
- Restriction enzymes, 10x buffers, BSA.
F. Alkali treatment for the RNA-containing oligo.
- 1 M of NaOH solution.
- 1.2 M of HCl solution.
- 1 M of Tris-HCl, pH 7.4 solution.
Referencias
- Storici, F., Bebenek, K., Kunkel, T. A., Gordenin, D. A., Resnick, M. A. RNA-templated DNA repair. Nature. 447, 338-3341 (2007).
- Storici, F., Resnick, M. The delitto perfetto approach to in vivo site-directed mutagenesis and chromosome rearrangements with synthetic oligonucleotides in yeast. Methods Enzymol. 409, 329-345 (2006).
- Storici, F. RNA-mediated DNA modifications and RNA-templated DNA repair. Curr Opin Mol Ther. 10, 224-230 (2008).
- Cerritelli, S. M., Crouch, R. J. Ribonuclease H: the enzymes in eukaryotes. FEBS J. 276, 1494-1505 (2009).
