التصوير البروتين البروتين التفاعلات في الجسم الحي</em
Summary
هذا البروتوكول صورة توضح كيفية البروتين البروتين التفاعلات باستخدام مقايسة القرب الحنق مقرا لها.
Abstract
البروتين البروتين التفاعلات هي السمة المميزة لجميع العمليات الخلوية الأساسية. ومع ذلك ، فإن العديد من هذه التفاعلات هي عابرة ، أو ضعيفة بقوة ، ومنع التعرف عليهم من خلال وسائل التحليل والكيمياء الحيوية التقليدية مثل مناعي المشترك. في هذا الصدد ، فإن البروتينات الفلورية encodable وراثيا (GFP ، RFP ، الخ) وما يرتبط بها من تداخل الطيف مضان أحدثت ثورة في قدرتنا على رصد التفاعلات الضعيفة في الجسم الحي باستخدام الرنين فورستر نقل الطاقة (الحنق) 1-3. هنا ، ونحن من التفصيل استخدامنا لفحص القرب الحنق مقرها لرصد التفاعلات مستقبلات مستقبلات على سطح الخلايا البطانية.
Protocol
Discussion
هناك العديد من الخطوات التي تعتبر بالغة الأهمية لتحقيق النجاح. وأبرز هؤلاء هو التعبير المستويات النسبية بين المستقبلات two خيالية. للتحايل على هذه المشكلة ، يمكن للمرء أن جعل خطوط الخلية مستقرة التعبير عن كل من البروتينات في المصالح ، أو تحديد نسب الأمثل للناقلات الحمض النووي للسماح التعبير ما يعادلها. وبالمثل ، نظرا لغير موحدة ترنسفكأيشن عبر الطبق ، ونادرا ما تكون مستويات بروتين يعادل بين الخلايا. ولذلك ، يجب إيلاء الاهتمام للتمييز 'العالية' expressors من "منخفضة". تلك المستويات "متوسط" عرض من البروتين العائد عادة موثوقة وقابلة للتكرار الحنق الكفاءة. أسلوب واحد مختبرنا اتبعت للتخفيف من هذه المشكلة هو استخدام والفيروسات الغدة lenti إلى التعبير الجيني "حتى". وعلاوة على ذلك ، وهي طريقة بديلة لتبيض الصور متقبل لتحديد الكفاءة والحنق الانبعاثات توعيتهم. على الرغم من أنه على الرغم من احتمال انبعاث توعية لرصد الخلايا واحد في الوقت الحقيقي ، لقد تم العثور على الصور وتبييض متقبل أن تكون أكثر حساسية وأكثر موثوقية.
أخيرا ، يمكن أن تستخدم لرصد التفاعلات الحنق البروتين يمكن أن يكون تحديا ويتطلب الاختيار الدقيق للأطوال رابط لمستقبلات غشاء محدد. علاوة على ذلك ، إضافة C / YFP غالبا ما يؤثر بشكل كبير على مستويات بروتين تعبير وتجميع النتائج في الشبكية في هيولي باطني وجهاز جولجي. ومع ذلك ، لتفاعلات عابرة ، أو غير مستقرة ، والحنق هي المنهجية المثلى لاستخدامها.
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونود أن ننوه الدكتور سكوت هندرسون للمساعدة في الفحص المجهري متحد البؤر. وأيد هذا البحث من المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة ل1RO1CA127501 WAB فضلا عن تمويل المشاريع التجريبية من مركز السرطان ماسي وكلية الطب (جامعة فرجينيا كومنولث) لالميكروسكوب WAB أجريت في جامعة فرجينيا كومنولث ، دائرة. بيولوجيا الأعصاب وعلم التشريح مرفق الميكروسكوب ، دعمت ، في جزء منه ، وذلك بتمويل من مركز NIHNINDS 5P30NS047463 منحة الأساسية.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| DMEM | Invitrogen | 11960-069 | ||
| Penicillin- Streptomycin | Invitrogen | 15070-063 | ||
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | N/A | ||
| Opti-MEM | Invitrogen | 11058-021 | ||
| FUGENE 6 | Roche | 11814443001 | ||
| Coverslip Dishes | MatTek Corp. | P35G014C | ||
| pcDNA3.1(+) | Invitrogen | V790‐20 | ||
| Mach 1 Competent Cells | Invitrogen | C862003 |
Referencias
- Kim, M., Carman, C. V., Springer, T. A. Bidirectional transmembrane signaling by cytoplasmic domain separation in integrins. Science. 301, 1720-1725 (2003).
- Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. Partitioning of lipidmodified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells. Science. 296, 913-916 (2002).
- Seegar, T. C. M., Eller, B., Tzvetkova-Robev, D., Kolev, M., Henderson, S. C., Nikolov, D. B., Barton, W. A. Tie1-Tie2 interactions mediate functional differences between angiopoietin ligands. Molecular Cell. 37 (5), 643-655 (2010).
- Edgell, C. J., McDonald, C. C., Graham, J. B. Permanent cell line expressing human factor VIII-related antigen established by hybridization. Proc Natl Acad Sci U S A. 80 (12), 3734-3737 (1983).
