Induktion und Beurteilung der Class Schalter Rekombination in Purified Murine B-Zellen
Summary
Nach Antigen Exposition unterziehen Subpopulationen von aktivierten B-Zellen ein Verfahren, wie class switch Rekombination (CSR) bekannt, dass Antikörper-Isotypen mit unterschiedlichen Effektorfunktionen zu produzieren. Das Protokoll in diesem Bericht beschriebenen erklärt, wie CSR induziert und analysiert werden können<em> In-vitro-</em> Für die Zwecke des Studiums B-Zell-Funktion.
Abstract
Humorale Immunität ist der Zweig des Immunsystems durch B-Zellen gehalten und vermittelt durch die Sekretion von Antikörpern. Bei B-Zell-Aktivierung, erfährt der Immunglobulin-Locus eine Reihe von genetischen Veränderungen, die Bindekapazität und Effektor-Funktion der sekretierten Antikörper verändern. Dieser Prozess wird durch eine genomische Rekombination Veranstaltung als Klasse-Schalter Rekombination (CSR), in denen die Standard-IgM-Antikörper-Isotyp für einen IgG, IgA, IgE oder substituierten bekannt ist hervorgehoben. Jeder Isotyp besitzt verschiedene Effektor-Funktionen wodurch CSR entscheidend für die Aufrechterhaltung der Immunität.
Die Diversifizierung der Immunglobulin-Locus wird durch das Enzym activation-induced Cytidindeaminase (AID) vermittelt. Eine schematische Video beschreibt diesen Prozess im Detail ist online verfügbar (http://video.med.utoronto.ca/videoprojects/immunology/aam.html). AID-Aktivität und der CSR-Weg werden häufig bei der Beurteilung der B-Zell-Funktion und humoralen Immunität in Mäusen untersucht. Das Protokoll in diesem Bericht beschriebenen präsentiert eine Methode der B-Zell-Isolierung von murinen Milz und nachfolgende Stimulation mit bakteriellem Lipopolysaccharid (LPS) zu induzieren Klasse Umstellung auf IgG3 (für andere Antikörper-Isotypen siehe Tabelle 1). Darüber hinaus ist das fluoreszierende Zellfärbung Farbstoff Carboxyfluorescein Succinimidylester (CFSE) verwendet werden, um die Zellteilung der stimulierten Zellen, ein Prozess von entscheidender Bedeutung für Schalt-1, 2 Isotyp zu überwachen.
Die Regulierung der AID und der Mechanismus, durch den CSR auftritt, sind noch unklar und somit in vitro-Klasse-Schalter Assays bieten eine zuverlässige Methode zur Prüfung dieser Prozesse in verschiedenen Mausmodellen. Diese Assays wurden bereits im Zusammenhang mit der Gen-Mangel mit Knockout-Mäusen 3 verwendet. Darüber hinaus können in vitro Schalten von B-Zellen durch virale Transduktion vorangestellt werden, um die Genexpression durch RNA-Zuschlag oder Transgenexpression 4-6. Die Daten aus dieser Art von Experimenten haben unser Verständnis der AID-Aktivität, die Auflösung der CSR-Reaktion und Antikörper-vermittelte Immunität in der Maus beeinflusst.
Protocol
Discussion
Das Protokoll skizzierten bietet einen Standard-Test, um AID Expression und Funktion während des Unterrichts Schalten von primären murinen B-Zellen zu analysieren. Dieses Protokoll verwendet bakterielle LPS zu induzieren Wechsel von IgM zu IgG3, obwohl Änderungen an der Stimulation Medien gemacht zu veranlassen, auf andere Isotypen (zusammengefasst in Tabelle 1 8, 9).
Wir haben festgestellt, dass für noch nicht bekannte Gründe, fetales Kälberserum kann das Niveau der Klasse …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir sind dankbar für die Martin-Labor für hilfreiche Diskussionen. Diese Publikation wird durch einen Zuschuss von der Canadian Institute of Health Research (MOP-89783) unterstützt. AM wird durch einen Canada Research Chair Tier II-Award unterstützt.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Phosphate Buffered Saline | Gibco | 14190 | ||
| EasySep Mouse B Cell Enrichment Kit | Stemcell Technologies | 19754 | ||
| Polystyrene tubes | Becton Dickinson Falcon | 352058 | ||
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A7030 | ||
| CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit | Invitrogen | C34554 | ||
| Bovine Calf Serum | HyClone | SH30072.03 | ||
| RPMI 1640 Culture Medium | Gibco | 11875 | ||
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli | Sigma Aldrich | L6529 | ||
| β-mercaptoethanol | Gibco | 21985 | ||
| Fetal Bovine Serum | HyClone | SH30396.03 | ||
| Normal Mouse Serum | Jackson ImmunoResearch | 011-000 | ||
| Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) | Becton Dickinson Pharmingen | 553141 | ||
| Rat Anti-Mouse IgG3 | Becton Dickinson Pharmingen | 553401 |
Referencias
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