Montaggio agar stratificato: preparazione di embrioni zebrafish vivi per l'imaging a lungo termine con un microscopio invertito
Published: April 30, 2023
Abstract
Fonte: Upadhyay S., et.al. Un metodo di montaggio a strati per la microscopia confocale a time-lapse estesa di embrioni interi di zebrafish. J. Vis. Exp. (2020).
Questo articolo descrive un metodo per montare embrioni di zebrafish vivi per l’imaging a lungo termine. Questo metodo è conveniente e facile da eseguire utilizzando normali stoviglie di microscopia con fondo di vetro per l’imaging su microscopio invertito. Il montaggio viene eseguito in strati di agarosio a diverse concentrazioni.
Protocol
1. Preparazione degli embrioni Dopo l’accoppiamento, raccogliere embrioni in E3 in una piastra di Petri e incubarli a 26,5 °C per circa 28 ore prima del montaggio.NOTA: Ciò rallenta lo sviluppo degli embrioni in modo che gli embrioni siano approssimativamente a 30 gradi all’inizio dell’imaging. Anestetizzare gli embrioni in 0,016-0,020% tricaina in E3. Per inibire la pigmentazione, aggiungere PTU a una concentrazione di 200 μM. Dechorionare gli embri…
Representative Results
Figura 1 : Descrizione del metodo di montaggio. (A) Aggiungere l’embrione zebrafish al piccolo pozzo creato dal fondo di vetro nel piatto da 35 mm. (B) Aggiungere lo strato di agarosio 1 al piccolo pozzo per coprire l’embrione. (C) Posizionare con cura un vetro di copertura sul piccolo pozzo. (D) Aggiungere lo strato di agarosio 2 su tutto il fondo del piatto da 35 mm. (E) Aggiungere E3 al piatto. (F) Disegno schematico d…
Materials
| Low melting agarose | Sigma-Aldrich, MO | A9414 | Store dissolved solution at 4 °C |
| 35 mm glass bottom dishes with No. 0 coverslip and 10 mm diameter of glass bottom | MatTek Corporation, MA | P35GCOL-0-10-C | |
| Tricaine (MS-222) | Sigma-Aldrich, MO | E10521 | Store dissolved solution at 4 °C |
| N-phenylthiourea (PTU) | Sigma-Aldrich, MO | P7629 | Store dissolved solution at -20 °C |
| DMC4500 digital microscope camera | Leica | NA | |
| Micro cover glass 22×22 mm | VWR | 48366 067 |
Citar este artículo
Layered Agar Mounting: Preparing Live Zebrafish Embryos for Long-Term Imaging with an Inverted Microscope. J. Vis. Exp. (Pending Publication), e20186, doi: (2023).