Gelaagde agarmontage: levende zebravisembryo's voorbereiden op langetermijnbeeldvorming met een omgekeerde microscoop
Published: April 30, 2023
Abstract
Bron: Upadhyay S., et.al. Een gelaagde montagemethode voor uitgebreide time-lapse confocale microscopie van hele zebravisembryo’s. J.Vis. Exp. (2020).
Dit artikel beschrijft een methode om levende zebravisembryo’s te monteren voor langetermijnbeeldvorming. Deze methode is kosteneffectief en gemakkelijk uit te voeren met behulp van gewone microscopieschalen met glazen bodem voor beeldvorming op inverted microscope. De montage wordt uitgevoerd in lagen agarose in verschillende concentraties.
Protocol
1. Bereiding van embryo’s Oogst na de paring embryo’s in E3 in een petrischaal en incubeer ze ongeveer 28 uur bij 26,5 °C voordat je ze monteert.OPMERKING: Dit vertraagt de ontwikkeling van de embryo’s, zodat de embryo’s zich ongeveer in het 30 somietstadium bevinden aan het begin van de beeldvorming. Verdoof embryo’s in 0,016-0,020% Tricaine in E3. Om pigmentatie te remmen, voegt u PTU toe aan een concentratie van 200 μM. Dechorioneer de embryo’s met…
Representative Results
Figuur 1 : Beschrijving van de montagemethode. (A) Voeg het zebravisembryo toe aan de kleine put die door de glazen bodem in de schaal van 35 mm is gemaakt. (B) Voeg agaroselaag 1 toe aan de kleine put om het embryo te bedekken. (C) Plaats voorzichtig een afdekglas over de kleine put. (D) Voeg agaroselaag 2 toe aan de gehele bodem van de 35 mm schaal. (E) Voeg E3 toe aan de schaal. (F) Schematische tekening van een doorsn…
Materials
| Low melting agarose | Sigma-Aldrich, MO | A9414 | Store dissolved solution at 4 °C |
| 35 mm glass bottom dishes with No. 0 coverslip and 10 mm diameter of glass bottom | MatTek Corporation, MA | P35GCOL-0-10-C | |
| Tricaine (MS-222) | Sigma-Aldrich, MO | E10521 | Store dissolved solution at 4 °C |
| N-phenylthiourea (PTU) | Sigma-Aldrich, MO | P7629 | Store dissolved solution at -20 °C |
| DMC4500 digital microscope camera | Leica | NA | |
| Micro cover glass 22×22 mm | VWR | 48366 067 |
Citar este artículo
Layered Agar Mounting: Preparing Live Zebrafish Embryos for Long-Term Imaging with an Inverted Microscope. J. Vis. Exp. (Pending Publication), e20186, doi: (2023).