Human T isolement des lymphocytes, de la Culture et de l'analyse des migrations In Vitro</em
Summary
La migration des lymphocytes T se produit pendant homing vers les organes lymphoïdes, la sortie de la vascularisation, et entrer dans les tissus périphériques. Ici, nous décrivons un protocole qui peut être utilisé pour analyser la migration lymphocytaire T<em> In vitro</em>.
Abstract
La migration des lymphocytes T implique l'interaction adhésive des intégrines de surface des cellules avec des ligands exprimés sur d'autres cellules ou avec des protéines de la matrice extracellulaire. L'activation des intégrines spatiotemporelle précise d'un état de faible affinité à un état de haute affinité au bord leader de cellules est important pour la migration des lymphocytes T<sup> 1</sup>. De même, la rétraction de la cellule de bord de fuite, ou uropode, est une étape nécessaire au maintien de la persistance de l'intégrine-dépendante la motilité des lymphocytes T<sup> 2</sup>. De nombreuses approches thérapeutiques pour auto-immunes ou inflammatoires intégrines maladies cibles comme un moyen d'inhiber le recrutement excessif et la migration des leucocytes<sup> 3</sup>. Afin d'étudier les événements moléculaires qui régulent la migration des lymphocytes T humains, nous avons utilisé une<em> In vitro</em> Système d'analyser la migration des cellules sur un substrat en deux dimensions qui imite l'environnement que rencontre un lymphocyte T au cours de recrutement de la vascularisation. Les lymphocytes T sont d'abord isolé à partir de donneurs humains et sont alors stimulées et mises en culture pendant sept à dix jours. Pendant le test, les lymphocytes T sont admises à adhérer et migrer sur un substrat revêtu avec la molécule-1 d'adhésion intercellulaire (ICAM-1), un ligand pour intégrine LFA-1, et des cellules stromales-derived factor-1 (SDF-1). Nos données montrent que les lymphocytes T présentent une vitesse de migration des ~ 15 um / min. La migration des lymphocytes T peut être inhibée par le blocage de l'intégrine<sup> 1</sup> Ou par des inhibiteurs de la machinerie cellulaire qui régule actomyosine migration cellulaire<sup> 2</sup>.
Protocol
Discussion
Dans cette expérience, nous fournissons des détails sur un système simple pour analyser la motilité des lymphocytes T primaires humains. Dans les essais de migration in vitro ont été utilisés pour disséquer les rôles de nombreuses molécules et voies de signalisation impliquées dans la locomotion des différents types cellulaires. Certains contrôles essentiels à garder à l'esprit lorsque vous concevez votre propre expérience de notre protocole comprennent: 1) Non-adhésif ou non inté…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce projet a été soutenu par des subventions des National Institutes Health HL087088 (MK) et HL18208 (MK).
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| RPMI 1640 | Gibco | 11875 | ||
| FBS | Thermo Scientific | SH300070.03 | ||
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140 | ||
| 1-Step Polymorphs | Accurate Chemical | AN221725 | ||
| PHA | Remel/Fisher Scientific | R30852801 | ||
| Rec. human IL-2 | R&D Systems | 202-IL | ||
| Rec. human IL-15 | R&D Systems | 247-IL | ||
| Protein G | Sigma Aldrich | 19459 | ||
| Rec. human ICAM-1/Fc | R&D Systems | 720-IC | ||
| Rec. human SDF-1 | R&D Systems | 350-NS |
Referencias
- Hyun, Y. M., Chung, H. L., McGrath, J. L., Waugh, R. E., Kim, M. Activated integrin VLA-4 localizes to the lamellipodia and mediates t cell migration on VCAM-1. J Immunol. 183, 359-369 (2009).
- Morin, N. A., Oakes, P. W., Hyun, Y. M., Lee, D., Chin, Y. E., King, M. R., Springer, T. A., Shimaoka, M., Tang, J. X., Reichner, J. S., Kim, M. Nonmuscle myosin heavy chain IIA mediates integrin LFA-1 de-adhesion during T lymphocyte migration. The Journal of experimental medicine. 205, 195-205 (2008).
- Hyun, Y. M., Lefort, C. T., Kim, M. Leukocyte integrins and their ligand interactions. Immunologic research. , (2009).
