UPPDRAG esiRNA för RNAi screening i däggdjursceller

1. Högkvalitativ MISSION esiRNA bibliotek För varje gen av intresse de mest mottagliga och specifika mål region för RNAi väljs utnyttjar DEQOR algoritm (http://cluster-1.mpi-cbg.de/Deqor/deqor.html). 4 DEQOR poäng att tysta potentialen hos alla möjliga 21 nukleotider långa siRNA i ett mål-mRNA baserad på state-of-the art design-begränsningar 4. Dessutom är varje potentiell siRNA analyseras för eventuella korsreaktioner med andra gener genom att göra en BLAST sökning mot transkriptom organismens studeras. Programmet ger därmed en analys av den övergripande kvaliteten och över tysta kapacitet av de potentiella esiRNA (300-600 bp längd). Den valda region i mål-genen cDNA förstärks genom PCR med genspecifika primers flankerad av bakteriofag RNA-polymeras-promotor-sekvenser. Varje PCR-produkt som används för Mission esiRNA produktionen kontrolleras för identitet genom sekvensering och renhetsgrad av Caliper Labchip analys. Långa dubbelsträngat RNA är transkriberas av PCR-produkten med RNA-polymeras, följt av en glödgning av transkriberade delar. esiRNAs förbereds av begränsade enzymatisk nedbrytning av den långa dubbelsträngat RNA med hjälp av RNaseIII följt av rening genom anjonbindande utbyte kromatografi utnyttjar Q-sepharose spin kolonner. esiRNAs fälls och suspenderade i TE buffert. Avkastningen mäts genom UV-absorption mätningar och koncentrationen justeras genom att lösa upp i en lämplig volym av TE buffert. Den övergripande kvaliteten på slutprodukten kontrolleras av Caliper Labchip analys. 2. Välja en cellinje och optimera transfektion för screening Titrera mängder esiRNA (använd Eg5 som positiv och renilla-luciferas som negativ kontroll) och allt större transfektion reagens i en 384-brunnar, lägga till celler och inkubera i 48 timmar. Eg5 är en kinesin motor protein som behövs för bipolär spindelenhet och utarmning leder till en mitotiska gripande. Upprepa proceduren för olika transfektion reagens och cellinjer. Här använder vi HeLa celler odlade följande standard procedurer och oligofectamine (Invitrogen) som transfektion reagens. För att välja den optimala transfektion villkor räkna celler transfekterade med Eg5 esiRNAs som visar en mitotiska arrestering (runda formen) och det totala antalet celler transfekterade med renilla-luciferas (RLUC) esiRNA med ljusmikroskop. Välj skick med minst toxicitet för RLUC och de mest uttalade fenotypen för Eg5. En alternativ metod för optimering av transfektion villkor innebär en stabil cellinje som uttrycker EGFP (eller annan lämplig reporter gen) under kontroll av ett konstitutivt aktiv promotor. Efter transfektion av en esiRNA mot EGFP (eller en annan reporter gen) och RLUC (eller annan lämplig negativ kontroll esiRNA) mäter knock-down effekt och toxicitet genom t.ex. fluorescens hjälp cellsortering (FACS). Se till att den används esiRNA för EGFP är fullt komplement till mål-mRNA. 3. Installera den primära skärmen 5,6 Optimera pipettering noggrannhet för alla komponenter som används på ett automatiserat pipettering station (t.ex. Aquarius, Tecan och WellMate, Matrix). Eftersom pipettering parametrar ändras beroende på vilken typ av lösning, volym och plåt typ denna optimering måste upprepas för varje steg separat. Om möjligt bör pipetteringen stationen placeras i dragskåp huva för att undvika föroreningar. Alla använda komponenter bör saneras före användning antingen genom autoklavering om tillämpligt, eller genom att spraya med 75% etanol. Optimera tvätt-protokoll så att korskontaminering från väl till väl är utesluten. Detaljer för optimering av automatiserade pipettering kan inte ge för rymd-begränsningar och beror till stor del på den utnyttjade pipettering stationen. För ytterligare information hänvisas till tillverkare protokollet. Transfektera celler i 384-brunnars format med hjälp av optimerade villkor från ovan med esiRNAs för Eg5 och RLUC. Använd ett växlande mönster för Eg5 och RLUC esiRNA täcker hela plattan. Efter inkubation i 48 timmar fixera cellerna med kalla 100% etanol, rehydrera i PBS i 15 minuter, bets i 25 minuter i PBS som innehåller 1 mikrogram / ml DAPI och 100 mikrogram / ml RNas A (Qiagen). Slutligen tvättas med PBS och förvara vid 4 ° C. Mät intensitet DAPI-fluorescens i mikroskop till exempel om en Olympus ScanR system. Skapa ett histogram genom att markera DAPI intensitet mot mobilnummer och utvärdera fördelningen cellcykeln genom att beräkna andelen celler med DNA-innehåll 2N för G1-fas, <2N> 4N för S-fasen, 4N för G2/M-phase och > 4N för aneuploidi / polyploidi. Utvärdera homogenitet resultat under plattan. Ytterligare optimering behövs om resultaten skiljer sig markant att utesluta ställning effeCTS. Ett vanligt problem när man använder flera bra plattor ökar avdunstningen vid kanten brunnar under inkubationstiden. Detta leder till olika experimentella förhållanden i olika brunnar, som ofta översätts till tallrik-läge specifika effekter. Av denna anledning rekommenderar vi att lämna alla kanter brunnar tom för en skärm. För att ytterligare minimera avdunstning se till att inkubatorer hålls på hög luftfuktighet. Vi har också rutinmässigt använder avdunstning hinder såsom Corning andas förseglingstejpen som blockerar avdunstning. Även andra resurser för position effekter måste beaktas, t.ex. tekniska variant av avläsningen systemet (mikroskop, plattläsaren, etc.) eller variationer i vätskehantering (gradienter, homogen lösningar, etc). Den statistiska skillnader mellan positiva och negativa kontroller ger ett mått på betydelsen av sysselsatta analysen. En stor skillnad mellan negativ kontroll (eller bakgrundsljud, mock-kontroll) och prov måste fastställas innan själva screeningen. Ett bra mått för statistisk signifikans är Z-faktorn. Z-faktorn beräknas med följande ekvation: Z = 1 – (3 SD [sample] + 3 SD [håna]) * (| Av [sample] – Av [håna] |) -1, med SD: standardavvikelse, Av: genomsnitt. En Z-faktor på 1> Z> 0,5 indikerar en statistiskt signifikant separering av negativa kontroller (och buller) från de positiva kontrollerna 7. 4. Primära skärmen Förbered 384-brunnars plattor vävnadskulturer för transfektion av esiRNAs utnyttja optimerade villkor från ovan. Här använder vi 15ng esiRNA per brunn upplöst i 5μl TE buffert. Minst åtta manöverplatser per platta skall laddas med lämpliga positiva och negativa kontroller för de studerade biologiska processen (här: Eg5 och RLUC). För att undvika ställning effekter kanten brunnar är laddade med 5μl TE buffert bara. Lägg 5μl OptiMEM (Invitrogen) som innehåller 0.2μl Oligofectamine per brunn, blanda och inkubera i 20 minuter vid rumstemperatur. Lägg cellsuspension på transfektion blandningen (här: 40μl av en HeLa cellsuspension på 25 celler / l koncentration, vilket motsvarar 1000 celler per brunn) och inkubera i 72 timmar. Mät DNA-innehåll på ett automatiserat mikroskop (Olympus ScanR, se ovan). Utvärdera med hjälp av Z-score statistik för drabbade valet: Z-poäng beräknas för alla prov esiRNAs använder signalen för den negativa kontrollen som referens. Obs, är Z-score inte samma sak som Z-faktorn. Z-poäng ger ett statistiskt mått på betydelsen av prov värden i jämförelse med ett (mock-) kontroll. Den beräknas efter formeln: Z = (värde [sample] – genomsnitt [håna]) * standard-avvikelsen [hånar] -1. För slog val en tröskel måste tillämpas. Vanligtvis en betydelse kriterier som: 2 <Z <-2 används, men beroende på kvaliteten på datasetet, den studerade biologiska processen eller bara omfattningen av skärmen kan olika tröskelvärden tillämpas. Bredvid ganska lätt Z-score statistiken också mer avancerade matematiska metoder för utvärdering kan användas (ett första inne i den breda området för statistisk utvärdering av screening data kan hittas i Malo et al. 8). 5. Sekundär skärm och tryck validering En sekundär skärm följer den primära skärmen för att eliminera falska positiva på grund av experimentella fel eller ej åsyftade effekter. För den valda träffar samma förfarande som används i den primära skärmen bör upprepas för ett större antal replikat (3-5) för att möjliggöra en bättre statistisk utvärdering. För verifierade träffar en sekundär icke överlappande esiRNA (eller någon annan icke-överlappande tysta trigger) mot de mål som identifieras i den första skärmarna ska användas. Samma analys och avläsning bör tillämpas som för den primära skärmen. Ytterst valda gener kan valideras av gränsöverskridande art RNAi räddning 9. Därmed en bakteriell konstgjord kromosom (BAC) kodning t.ex. mus ortholog av genen är stabilt transfekterade i celler. BAC-konstruktioner bevara en gen i sin genomiska sammanhang och möjliggöra en nästan fysiologiska uttryck. RNAi mot kroppsegna mänskliga genen kommer att lämna uttrycket musen transgenen oförändrade som räddar RNAi-fenotyp. RNAi-räddning ger guld-standard för kontroll av RNAi fenotyper tillgängliga. Slutligen är validerade kandidater studeras mer i detalj för att så småningom dra mekanistisk förståelse. I många fall RNAi kan användas i dessa experiment, t ex i sekundära, mer avancerade analyser.