Elettrosaldabili cellula visualizzate con microscopia a fluorescenza

I. Caricamento delle celle con celle inseguitori CMFDA e CMRA Gli esperimenti sono stati condotti su cellule precedentemente preparato delle linee cellulari di melanoma mouse (B16-F1). Le cellule sono coltivate in due separate 25 cm 2 fiasche cultura (TPP, ZDA) al 70-80% confluenza nel terreno di coltura DMEM (Dulbecco modificato medio di Eagle) supplementato con 10% siero fetale bovino, 0,15 mg / ml L-glutamina, 16 mg / ml di gentamicina (tutti da Sigma-Aldrich, Germania), 200 unità / ml crystacillin (Pliva, Croazia), e incubate nel 5% CO 2 a 37 ° C. Preparare due soluzioni da 10 mM stock di inseguitori Cell (Invitrogen, USA) con l'aggiunta di 10,76 microlitri e 9 microlitri (per il verde CMFDA e per Orange CMRA, rispettivamente) di DMSO (Sigma-Aldrich, Germania) a 50 mg del colorante in originale Invitrogen flaconcino. La soluzione madre può essere conservato in frigorifero a 4 ° C per pochi mesi. Prima di iniziare gli esperimenti, riscaldare la soluzione fino a quando i cristalli di DMSO sciogliere. Preparare bicarbonato senza Krebs-tampone HEPES (130 mM NaCl, 4.7 mM KCl, 1,2 mM MgSO 4, 1,2 mM KH 2 PO 4, 11,7 mm D-glucosio, 1,3 mM CaCl 2, 10 HEPES mM, pH 7,4). In due tubi da 15 ml Eppendorf separatamente mix 2,1 ml di ciascuna soluzione madre (10 mM CMFDA o CMRA, rispettivamente) in 3 ml di bicarbonato senza Krebs-tampone HEPES. Questo produce una "soluzione di carico" che contiene circa 7 mM CMFDA (o CMRA). Lavare le cellule due volte con il bicarbonato senza Krebs-tampone HEPES e quindi inserire il caricamento soluzioni nelle beute. Incubare le cellule per 30 minuti in 5% CO 2 a 37 ° C. Durante questo reagenti incubazione prima passare liberamente attraverso le membrane delle cellule, ma una volta all'interno della cellula, i reagenti si trasformano in cellule impermeant prodotti di reazione fluorescente. Dopo la prima incubazione, lavare e incubare cellule con terreno di coltura per altre due ore in 5% CO 2 a 37 ° C. Trypsinize cellule in entrambi i flaconi (caricato con CMFDA e CMRA) e mescolare globuli rossi e verdi insieme in un rapporto di 1:1 in un tubo da centrifuga da 50 ml (TPP, ZDA). Regolare la concentrazione cellulare di 5 x 10 6 cellule / ml per diluizione con mezzo di DMEM o mediante concentrazione con centrifuga. Inserire una goccia 20 ml di sospensione di cellule in ciascun pozzetto della piastra 24 pozzetti (TPP, ZDA). Incubare cellule nel 5% CO 2 a 37 ° C per 20 minuti per consentire loro di attaccare un po 'alla superficie del pozzo e stabilire contatti cell. II. Elettrofusione Preparare isoosomolar tampone fosfato di potassio (10 mM KH2PO4, 10 mM K 2 HPO 4, 1mM MgCl2, 250 mM saccarosio) e hypoosmolar tampone fosfato di potassio (10 mM KH2PO4, 10 mM K 2 HPO 4, 1mM MgCl2, 75 mM saccarosio) . Posizionare il pozzetti con le cellule al microscopio sul palco, la posizione degli elettrodi sul fondo del pozzo e collegarli al generatore di impulsi. Lavare le cellule con 1 ml di isoosomolar tampone fosfato di potassio. Aggiungere 350 ml di hypoosmolar tampone fosfato di potassio al fine di indurre rigonfiamento delle cellule. Il buffer dovrebbe coprire gli elettrodi. Lasciare le cellule nel buffer hypoosmolar per 2 minuti prima di applicare gli impulsi elettrici. Durante questo periodo afflusso di molecole d'acqua all'interno delle cellule a causa di squilibrio osmotico tra l'interno e l'esterno delle cellule causano un aumento del volume cellulare. Impulsi elettrici devono essere applicate quando le cellule sono vicini al loro volume massimo, prima di iniziare a regolamentare diminuire il volume. Per raggiungere elettrofusione ottimale e mantenere la vitalità cellulare, i parametri ottimali di impulsi elettrici devono essere utilizzati. Questi dipendono da linee cellulari utilizzate [1]. In questo esperimento un treno di 8 impulsi rettangolari (ciascuno con durata di 100 ms a 1 Hz) viene applicato a ciascun campione, utilizzando un dispositivo elettroporazione (nel nostro caso Cliniporator, IGEA, Italia). Gli impulsi vengono consegnati a due parallele Pt / Ir elettrodi a filo da 0,8 mm di diametro e 5 mm di distanza tra loro, creando un campo elettrico di circa 1200 V / cm tra gli elettrodi in ogni bene, tranne per il controllo dei pozzi. Lasciare le cellule indisturbato per 10 minuti dopo la consegna degli impulsi. Determinare il rendimento di fusione mediante microscopia a fluorescenza e contrasto di fase. III. Acquisizione di immagini e la determinazione del rendimento fusione Le cellule sono osservati utilizzando un microscopio a fluorescenza (nel nostro caso Zeiss Axiovert 200, Zeiss, Germania) equipaggiato con un obiettivo (x20) ed una camera CCD raffreddata (VISICAM 1280, Visitron, Germania). Le immagini vengono acquisite in MetaMorph 7.1.1 (Molecular Devices, USA), ma altri software di acquisizione simili possono anche essere utilizzati. CMFDA è eccitato con un monocromatore (policroma IV, Visitron, Germania) a 492 nm e CMRA a 548 nm. La fluorescenza della CMFDA e CMRA viene eseguita utilizzando due filtri di emissione, uno centrato a 535 nm (HQ535/30m, per CMFDA) e l'altra centrata a 510 nm (D605/55m, per CMRA, sia Chroma, USA). L'uso di specchi dicroici (Q515LP) hanno impedito la cross talk canale. Acquisire tre immagini (contrasto di fase, fluorescenza rossa e verde) per cinque campi scelti a caso in ciascun pozzetto. Creare tre immagini per ogni canale tripletta immagine. In tale immagine citoplasma fluorescenti possono essere visti insieme con le membrane cellulari. Cellule fuse può quindi essere facilmente determinato [Figura 1]. Contare tutti e tre i tipi di cellule (rosso, verde e fluorescente doppiamente) in ogni immagine a tre canali. Determinare la percentuale di cellule doppiamente fluorescenti dividendo il numero di cellule doppiamente fluorescenti con il numero di tutte le cellule in ogni immagine. Resa fusione è definita come la percentuale di cellule doppiamente fluorescenti moltiplicato per 2 in quanto la metà delle cellule fuse non vengono rilevati (quando le cellule del fusibile stesso colore). Rappresentante Risultati Figura 1 Tre immagine microscopia canale di B16F1 cellule dopo elettrofusione:. Contrasto di fase, CMRA fluorescenza (eccitazione a 548 nm) e CMFDA fluorescenza (eccitazione a 492 nm), ingrandimento obiettivo 20x