Électrofusion cellulaire visualisé par microscopie à fluorescence

I. Chargement des cellules avec les cellules et les trackers CMFDA SACSM Des expériences ont été réalisées sur des cellules préalablement préparé de la lignée cellulaire de souris mélanome (B16-F1). Les cellules sont cultivées dans deux flacons séparés 25 cm de la culture 2 (PPT, ZDA) à 70-80% de confluence dans un milieu de culture DMEM (milieu de Dulbecco modifié Eagle) complété avec 10% de sérum de veau fœtal, 0,15 mg / ml de L-glutamine, 16 mg / ml de gentamicine (tous de Sigma-Aldrich, Allemagne), 200 unités / ml crystacillin (Pliva, Croatie), et incubés dans 5% de CO 2 à 37 ° C. Préparer deux solutions mères 10 mM de trackers cellulaire (Invitrogen, USA) en ajoutant 10,76 ul ul et 9 (pour le vert et le CMFDA pour Orange SACSM, respectivement) de DMSO (Sigma-Aldrich, Allemagne) à 50 pg du colorant dans l'original flacon Invitrogen. La solution stock peut être stockée dans un réfrigérateur à 4 ° C pendant quelques mois. Avant de commencer les expériences, de réchauffer la solution jusqu'à ce que les cristaux se dissolvent de DMSO. Préparer le bicarbonate sans tampon Krebs-HEPES (130 mM NaCl, 4,7 mM de KCl, 1,2 mM MgSO 4, 1,2 mM KH 2 PO 4, 11,7 mM D-glucose, 1,3 mM de CaCl2, 10 mM d'HEPES, pH 7,4). Dans deux tubes de 15 ml Eppendorf séparément mélange de 2,1 l de chaque solution mère (10 mM CMFDA ou CMRA, respectivement) dans 3 ml de bicarbonate sans tampon Krebs-HEPES. Cela donne une «solution de chargement" contenant environ 7 uM (ou SACSM) CMFDA. Rincer les cellules deux fois avec du bicarbonate sans tampon Krebs-HEPES, puis insérez le chargement des solutions dans les flacons. Incuber les cellules pendant 30 minutes dans 5% de CO 2 à 37 ° C. Durant cette première incubation réactifs passer librement à travers les membranes cellulaires, mais une fois dans la cellule, les réactifs sont transformés en cellules imperméants produits de la réaction fluorescente. Après une incubation d'abord, rincez et incuber les cellules avec un milieu de culture pendant deux heures dans 5% de CO 2 à 37 ° C. Trypsiniser cellules dans les deux flacons (chargé avec CMFDA et SACSM) et mélanger les globules rouges et verts ainsi que dans un rapport 1:1 dans un tube à centrifuger de 50 ml (PPT, ZDA). Ajuster la concentration de cellules de 5 x 10 6 cellules / ml par dilution avec du milieu DMEM ou par concentration avec la centrifugeuse. Déposer une goutte 20 pl de suspension cellulaire dans chaque puits de la plaque 24 multipuits (PPT, ZDA). Incuber les cellules dans 5% de CO 2 à 37 ° C pendant 20 min pour leur permettre de peu s'attachent à la surface du puits et établir des contacts cellulaires. II. Électrofusion Préparer isoosomolar tampon phosphate de potassium (10 mM KH2PO4, 10 mM K 2 HPO 4, 1 mM MgCl2, 250 mM de saccharose) et hypoosmolaire tampon phosphate de potassium (10 mM KH2PO4, 10 mM K 2 HPO 4, 1 mM de MgCl2, 75 mM de saccharose) . Placez le multipuits avec des cellules sur la platine du microscope, la position des électrodes au fond du puits et les connecter au générateur d'impulsions. Laver les cellules avec 1 ml de tampon phosphate de potassium isoosomolar. Ajouter 350 ul de tampon phosphate de potassium hypoosmolaire afin d'induire un gonflement cellulaire. Le tampon devrait couvrir les électrodes. Laisser les cellules dans un tampon de hypoosmolaire pendant 2 minutes avant d'appliquer des impulsions électriques. Durant cet afflux de temps des molécules d'eau dans les cellules en raison d'un déséquilibre osmotique entre l'intérieur et l'extérieur des cellules provoque une augmentation du volume cellulaire. Impulsions électriques doivent être appliqués lorsque les cellules sont proches de leurs volumes maximum, avant le début diminuer le volume de la réglementation. Pour atteindre et maintenir électrofusion optimale la viabilité des cellules, les paramètres optimaux d'impulsions électriques doivent être utilisés. Celles-ci dépendent lignée cellulaire utilisée [1]. Dans cette expérience, un train de 8 impulsions rectangulaires (chacune avec une durée de 100 ms à 1 Hz) est appliquée à chaque échantillon, en utilisant un dispositif d'électroporation (dans notre cas, Cliniporator, IGEA, Italie). Les impulsions sont délivrées à deux électrodes parallèles de fil de Pt / Ir de 0,8 mm de diamètre et 5 mm de distance entre eux, créant un champ électrique d'environ 1200 V / cm entre les électrodes dans chaque puits, sauf pour le contrôle du puits. Laisser les cellules au repos pendant 10 minutes après la livraison du pouls. Déterminer le rendement de fusion par le biais de la microscopie fluorescente et de contraste de phase. III. L'acquisition d'images et de la détermination du rendement de la fusion Les cellules sont observées en utilisant un microscope à fluorescence (dans notre cas Zeiss Axiovert 200, Zeiss, Allemagne) équipé d'un objectif (x20) et une caméra CCD refroidie (VisiCam 1280, Visitron, Allemagne). Les images sont acquises en MetaMorph 7.1.1 (Molecular Devices, USA), mais d'autres logiciels d'acquisition similaire peut également être utilisé. CMFDA est excité par un monochromateur (Polychrome IV, Visitron, Allemagne) à 492 nm et 548 nm au SACSM. La fluorescence de CMFDA et SACSM est acquise au moyen de deux filtres d'émission, l'un centré à 535 nm (HQ535/30m, pour CMFDA) et l'autre centrée à 510 nm (D605/55m, pour CARM, tant Chroma, USA). L'utilisation de miroir dichroïque (Q515LP) a empêché la diaphonie de canal. L'acquisition de trois images (contraste de phase, la fluorescence rouge et verte) pour cinq champs choisis au hasard dans chaque puits. Créer trois images de canal de chaque triplet d'images. Dans l'image telle cytoplasme fluorescent peut être vu avec les membranes cellulaires. Les cellules fusionnées peuvent ainsi être facilement déterminée [Figure 1]. Compter toutes les trois types de cellules (rouge, vert et doublement fluorescents) dans chaque image à trois canaux. Déterminer le pourcentage de cellules fluorescentes doublement en divisant le nombre de cellules fluorescentes doublement du nombre de toutes les cellules de chaque image. Fusion de rendement est défini comme le pourcentage de cellules fluorescentes doublement multiplié par 2 puisque la moitié des cellules fusionnées ne sont pas détectés (lorsque les cellules du fusible de même couleur). Les résultats représentatifs Figure 1 Trois images de microscopie canal de cellules B16F1 après électrofusion:. Contraste de phase, SACSM de fluorescence (excitation à 548 nm) et CMFDA fluorescence (excitation à 492 nm), grossissement de l'objectif 20x