Gründung Intrakranielle Brain Tumor Xenografts mit anschließender Analyse des Tumorwachstums und Ansprechen auf die Therapie mit Biolumineszenz-Bildgebung

1. Tumor Cell Preparation. Zellen für die menschliche Gehirn Tumorxenotransplantaten kann entweder bezogen werden von Tumoren vermehrt als subkutane Wachstum in athymischen Mäusen oder aus der Zellkultur. Die Nutzung beider Zellquellen ist nachfolgend zusammen mit Demonstration einer Methode für die Zell-Implantation behandelt. Zur Vorbereitung Zellen aus subkutane Tumoren für die Übertragung auf den intrakraniellen Raum, ausgeschnitten Flanke Tumoren in Kulturschalen gelegt, wo das Gewebe zunächst mit einem Skalpell und dann mechanisch zerstört durch wiederholtes Pipettieren zu einem Zellverband Suspension 1 erstellen zerkleinert. Die Zellverbandes Suspension wird dann durch einen 70 uM Nylon-Sieb-Filter, um einen einzigen Zellsuspension für intrakranielle Injektion produzieren weitergegeben. Die Zellsuspension wird bei 1000 rpm für 10 Minuten bei 4 ° C, und der Überstand vor Resuspendieren des Zellpellets in einem geeigneten Volumen von Serum-freien Medien zu einer endgültigen Arbeitskonzentration (siehe unten) erhalten abgesaugt zentrifugiert. Für die Herstellung etablierten Zelllinien für intrakranielle Implantation werden die Zellen durch trypsinizing Monoschichten geerntet, oder durch das Sammeln von Neurosphäre Suspensionskulturen, dann Zentrifugieren und Resuspendieren der Zellen wie oben 2 angegeben. Die Anzahl der Zellen injiziert wird abhängige Variable neuroanatomischen Ort der Injektion. Für supratentoriellen Injektionen wir routinemäßig injiziert 3-5 x 10 5 Zellen in 3 ul Serum-freien Medien (DMEM), während für Hirnstamm-Injektionen 3, so wenig wie 5 x 10 4 Zellen in 0,5 ul injiziert werden. Injektion größerer Mengen als empfohlen können in Tumorzellen Rückfluss durch die Nadel-Darm-Trakt führen, mit den daraus resultierenden exophytischen (Abbildung 1), anstatt intrakraniellen Tumorwachstum. Nach dem Abziehen Probe für intrakranielle Injektion sollte die verbleibende Zellsuspension in Eis gelegt werden, mit Inhalt häufig geeignete Konzentration aufrecht zu erhalten, beim Ausfüllen intrakranieller Tumor Etablierung unter den Mitgliedern einer Injektion Serie gemischt. 2. Tumorzellimplantation Beachten Sie haben alle unten beschriebenen Verfahren geprüft und von der Institutional Tierexperimente und Ausschuss an der University of California San Francisco verabschiedet. Der OP-Bereich sollten durch Besprühen Sie alle Oberflächen mit einem Desinfektionsmittel, wie z. B. 2% Chlorhexidin-Lösung hergestellt werden. Nach dem Einsatz des Desinfektionsmittels, sollten die folgenden Lieferungen in den OP-Bereich platziert werden: Heizkissen für Maus Körpertemperatur aufrecht zu erhalten Zwei kleine Petrischalen, eine mit 3% Wasserstoffperoxid und einem Gehalt von 2% Chlorhexidin Sterile Gaze und Wattestäbchen Sterile Einweg-Skalpelle Autoklaviert chirurgischen Hefter Für Anästhesie injizierten Narkosemittel verwendet werden sollten; typischerweise ein Ketamin-Xylazin Gemisch. Sobald eine Maus betäubt, ist die Kopfhaut durch Abtupfen mehrmals mit einem Stück steriler Gaze eingetaucht in das Chlorhexidin-Lösung hergestellt. Augensalbe auftragen, um ausreichend Feuchtigkeit während des Verfahrens aufrecht zu erhalten. Mit einem sterilen Skalpell, komplett eine sagittale Inzision über dem parieto-occipital Knochen, ca. 1 cm lang. Die exponierte Schädel Oberfläche wird dann gereinigt mit einem Wattestäbchen in eine 3% ige Wasserstoffperoxid-Lösung getränkt. Die Bregma sollte an dieser Stelle deutlich (siehe Video). Die Koordinaten für die Injektion von Tumorzellen wird nach den gewünschten Ort für die Tumor-Einrichtung variieren. Die nachfolgende Tabelle zeigt das Verfahren, die wir für intrazerebrale Tumoren Einrichtung 2 in einer neuroanatomischen Ort, an dem viele Menschen mit Hirntumoren Erfahrung Tumorentwicklung. Weitere Standorte von Interesse in Gehirntumor Forschung sind die Brücke, für anatomische Modellierung von Hirnstammtumoren 3 und subdurale Injektionen für die Modellierung der Lage meningealen Tumoren 4. Vor Tumorzelleninjektion, verwenden Sie eine sterile 25-Gauge-spitzen Nadel zu durchstechen der Schädel bei 2 mm auf der rechten Seite des Bregma und 1 mm anterior der Kranznaht, wodurch eine Öffnung für die Injektion von Tumorzellen (siehe Video). Dieses Verfahren eignet sich gut für beide Mäuse und Ratten (22 Gauge-Nadel für Ratten). Vor Zeichnung Zellen in die Spritze, mischen Sie den Inhalt der Zellsuspension durch Antippen mit dem Finger. Legen Sie die Spritze mit der gewünschten Menge an Zellsuspension, wobei darauf zu vermeiden, Luftblasen. Die Außenseite der Spritze sollte dann mit einem Alkoholtupfer gereinigt werden, um das Äußere frei von anhaftenden Zellen, die verhindern extrakraniellen Tumor Bildung und Entwicklung (Abbildung 1A) wird abwischen. Um sicherzustellen, dass die entsprechende Injektion Tiefe erreicht ist, verwenden Sie ein Skalpell zu 3mm aus dem spitzen Ende eines P20 pipetteman Spitze abgeschnitten. Dieser Abschnitt der Spitze kann über die Spritze ausgerüstet werden und wird handeln, um die Injektion Tiefe zu begrenzen, und wird darüber hinaus sicherstellen, dass die tip der Spritzennadel ist 3mm von der Unterseite des Schädels. Legen Sie die Spritze senkrecht auf den Schädel und in das Loch zuvor erstellt haben, und injizieren Sie langsam die Zellsuspension (a 3μL Suspension sollte über eine 1 Minute Zeit injiziert werden). Eine ungeeignete Winkel Spritze Insertion kann in intraventrikuläre Injektion von Zellen und die anschließende Verbreitung der Wirbelsäule (Abb. 1B: Right) Ergebnis Nach Abschluss der Injektion lassen Sie die Nadel in Platz für eine weitere Minute, dann langsam zurückziehen (siehe Video): diese Schritte wird dazu beitragen, Tumorzellen Reflux. Als Alternative zu der ohne fremde Hilfe oder Free-Hand-Ansatz zur intrakraniellen Tumorzellimplantation 5, kann man ein kleines Tier stereotaktischen Rahmen (Panel F schematische Übersicht), die in der Regel fördert eine konsequente Injektionsstelle, aber auf Kosten der erhebliche Mengen an Verfahrensfristen. Nach unseren Erfahrungen können zwei OP-Personal spritzen bis zu 60 Mäuse / Stunde bei Verwendung der freien Hand-Ansatz, während maximal Einspritzmenge mit einem kleinen Tier stereotaktischen Rahmen liegt bei ca. 15 Mäuse / Stunde. Procedural Zweckmäßigkeit ist ein wichtiger Aspekt bei der Injektion große Reihe von Mäusen und reduziert die Zeit, in der Tumorzellen, die injiziert werden, auf Eis gelassen werden. Reinigen Sie den Schädel mit 3% Wasserstoffperoxid und trocken mit einem sterilen Wattestäbchen. Bewerben sterile Knochenwachs, um das Loch. Mit einer Zange, ziehen die Kopfhaut zusammen über den Schädel und heften sich zu schließen. Für eine optimale Heilung, sollte die Kopfhaut mit der Dermis von jeder Seite der Kopfhaut gegeneinander (Unterseite gegen Unterseite) geheftet werden. Die geheftet Kopfhaut zu reinigen mit Chlorhexidin-Lösung, und Buprenorphin dann durch subkutane Injektion zur postoperativen Schmerzlinderung verabreicht werden. Überwachen Sie alle Mäuse post-operativ, bis sie ambulant und zu behalten normale Aktivität. Typischerweise wird Erholzeit ca. 30 Minuten. 3. Biolumineszenz Überwachung des Tumorwachstums Background. Biolumineszenz-Bildgebung (BLI) ist auf die Oxidation von Luciferin Basis [(-) -2 – d-(60-Hydroxy-20-benzothiazolyl)-thiazone-4-carbonsäure] in Gegenwart von Sauerstoff und Adenosintriphosphat (ATP). Diese Reaktion wird durch das Enzym Luciferase, die chemische Energie in Photonen mit den daraus resultierenden Emission von Licht katalysiert. Menschliche Zellen können modifiziert werden, um Luciferase exprimieren (siehe unten), nur mit Luciferase-exprimierenden Zellen in der Lage, Licht in die Gegenwart des Luciferin-Substrat werden. Es ist minimal Hintergrundlumineszenz von Tieren Hosts mit Luciferin behandelt, so dass es ein sehr günstiges Signal-Rausch-Verhältnis zur Detektion von Lumineszenz-Emissionen aus der Luciferase-modifizierten Tumorzellen, so dass hochsensible Überwachung des Tumorwachstums und Ansprechen auf die Therapie in vivo. Darüber hinaus haben Luciferase und ihr Substrat, Luciferin, konnte gezeigt werden, nicht toxisch für Säugetierzellen, und wir haben keine funktionalen Unterschiede zwischen den Zellen, die Luciferase gegenüber entsprechenden unveränderten Zellen beobachtet. Luciferin leicht Kreuze Zellmembranen und die Blut-Hirn-Schranke nach intraperitonealer (ip) oder intravenöse (iv) Injektion bei Mäusen, so dass bildgebende jedes Fach, Luciferase-modifizierten Zellen enthält. Die Höhe der Photonenemission und das Spektrum des emittierten Lichts von Luciferase-modifizierten Zellen ausreichend ist, um Gewebe von kleinen Versuchstieren wie Mäusen und Ratten zu durchdringen, und kann extern mit Low-Light Imaging Kameras erkannt werden. Die nicht-invasive Natur der Biolumineszenz-Bildgebung ermöglicht wiederholte Überwachung von Tumorwachstum und Ansprechen auf die Therapie in einzelnen Tieres Themen. Implantierten Zellen Quellen sollten stabil für firefly Luciferase-Expression verändert werden. Solche Zellen Quellen können gekauft werden, oder hergestellt in einzelnen Labors mit Lentivirus, dass für eine konstitutive Expression von Luciferase gebaut wurden. Wir empfehlen die Verwendung von Zellen mit Luciferase codiert Lentivirus, anstatt Plasmid modifiziert, um eine stabile zelluläre Expression von Luciferase in vivo, die notwendig ist für die quantitative Lumineszenzbildgebung gewährleisten eine genaue Angabe der Veränderungen in Tumorlast bieten für das einzelne Tier Themen, die wiederholt werden abgebildet im Verlauf eines Experiments. BLI-Überwachung. Wir empfehlen die Durchführung quantitativer Biolumineszenz-Bildgebung (qBLI) 1x-2x wöchentlich, beginnend eine Woche nach Tumorzelleninjektion. Unsere qBLI erfolgt mit den IVIS Lumina Imaging-Station (Caliper Life Sciences), und unsere Ergebnisse zeigen ähnliche Daten bei der Nutzung des IVIS Lumina, die IVIS 150, oder die IVIS 200 Imaging-Station erhalten. In Vorbereitung für die Bildgebung, sind Mäuse gleichzeitig mit Ketamin / Xylazin und verwaltet Luciferin (D-Luciferin Kaliumsalz, 150 mg / kg, Caliper Life Sciences) durch intraperitoneale Injektion mit Mäusen abgebildet 12 Minuten nach der Injektion. Die Pharmakokinetik von Luciferin darauf hin, dass die Zeit zwischen Verwaltungtration von Luciferin und Bestimmung der Zell-Lumineszenz sollte zwischen 10-15 Minuten nach der Injektion von Luciferin werden, um eine maximale Lumineszenzemission und größte Empfindlichkeit der Detektion zu erhalten. Die Länge der Zeit innerhalb der 10-15 Minuten Zeitintervall ausgewählt wird, sollte möglichst konstant unter den Tieren, dass ein Image erstellt wird beibehalten werden. Es ist äußerst wichtig, um die Konsistenz in der Länge der Zeit zwischen Injektion von Luciferin und Erhalt BLI Lesungen zu halten. Regionen von Interesse umfasst die intrakraniellen Bereich des Signals werden mithilfe Wohnen Image Software (Abbildung 2), und die gesamte photons/s/sr/cm2 (Photonen pro Sekunde pro Steradiant pro Quadratzentimeter) werden aufgezeichnet (siehe Video). Datenanalyse. Während das Tumorwachstum und Ansprechen auf die Therapie einzelner Tiere überwacht werden, empfehlen wir die Behandlung Gruppen von mindestens 8 zur Erhöhung der statistischen Sicherheit von Schlussfolgerungen in Bezug auf Ansprechen des Tumors, oder deren Fehlen, auf die Therapie. Im Hinblick auf die Vorlage qBLI Ergebnisse sind Lumineszenz-Messungen an normierten Werte, indem jeder Maus s Lumineszenz umgewandelt wird, erhalten während und nach Abschluss der Therapie-Schema, mit dem entsprechenden maximal Vorbehandlung Lumineszenz Lesen 6,7. Für das Überleben Analyse wird der Kaplan-Meier-Schätzer 8 verwendet, und von denen Überlebenskurven generiert werden, und die mediane Überlebenszeit ermittelt. Die Unterschiede zwischen den Überlebenskurven sind im Vergleich mit einem Log-Rank-Test 9. Retrieval des Gehirns für die anschließende Analyse der behandelten und unbehandelten Tumor. Bei Tier Euthanasie, sollte das Gehirn der Maus schnell ausgeschnitten werden (siehe Video), und entweder in Formalin für die anschließende Analyse von Tumor-Morphologie und Immunhistochemie platziert, oder sollte in OCT für Probe Einfrieren montiert werden. 4. Repräsentative Ergebnisse In dem Beispiel in Abbildung 3A gezeigt, waren Mäuse, die intrakranielle Tumorzelleninjektion für intrakranielle Lumineszenz überwacht, bis aufeinander bedeuten Lumineszenz angegebenen Werte progressive Wachstum von Tumoren, und zu welchem ​​Zeitpunkt Therapie eingeleitet wurde (grauer Pfeil ab Tag 34: Erlotinib täglich 150 mg verabreicht / kg, bis die gewünschte Sterbehilfe). Lumineszenz-Werte für jede Maus sind auf einen normierten Wert 1 zum Zeitpunkt der Einleitung der Therapie gesetzt, mit anschließender Lumineszenz Messungen für jede Maus normalisiert, um seine endgültige Vorbehandlung Imaging-Wert. Als Beispiel einer Maus mit einem letzten Vorbehandlung Lumineszenz Lesen von 2,0 x 10 7 Photonen / sec an Tag 34, deren Lumineszenz war auf 6,0 erhöht x 10 7 Photonen / sec am Tag 38, hätte einen Tag 38 normalisierten Lumineszenz-Wert von 3,0. Mittlere normalisierte Biolumineszenz und die entsprechenden Standardfehler für Kontroll-und Behandlungsgruppen werden für jedes Imaging Zeitpunkt aufgezeichnet. In diesem Beispiel wird ein signifikanter Unterschied in mittleren normalisierten Lumineszenz bei der ersten bildgebenden Zeitpunkt nach dem Beginn der Therapie (Tag 38) deutlich, mit dem Unterschied in der mittleren Gruppe Lumineszenz zeigen weitere Steigerung bei späteren Zeitpunkten. In den meisten Fällen ist die Anti-Tumor-Aktivität der Therapie, wie qBLI angegeben, durch eine entsprechende signifikanten Unterschied im Überleben (dh, p <0,05) begleitet, wie es hier der Fall (Abbildung 3B). Panels 3C und 3D zeigen neben Hämatoxylin & Eosin-und anti-EGFR-gefärbten Schnitten von Maus-Gehirn zum Zeitpunkt der Euthanasie erhalten folgende Platzierung der resezierten Gehirn in Formalin und anschließender Paraffin-Einbettung für das Schneiden. Abbildung 1. Indikationen intrakranieller Injektion Fehler. A) exophytischen (extrakraniellen) das Tumorwachstum (roter Kreis) kann durch eine zu große Einspritzmenge, restliche Zellsuspension an der Spritze verursacht werden, oder von der Rücknahme der Spritze zu schnell nach der Injektion der Tumorzellen. B) Injektion Tumorzellen in die Ventrikel kann dazu führen, Wirbelsäule Verbreitung von Tumorzellen (Maus nach rechts), im Gegensatz zu richtig injiziert Tumorzellen, das Signal für die an der Injektionsstelle (Maus nach links) lokalisiert bleibt. Abbildung 2. Heatmap Bild Darstellungen von Biolumineszenz Intensität für repräsentative Mäuse von Kontrolle (links) und Behandlung (rechts) Gruppen einer Therapie Antwort zu experimentieren. The Living Image Software kann so eingestellt werden regions of interest (rote Kreise) zu definieren, oder ein Instrument Betreiber können regions of interest manuell zu definieren. Für die Verwendung von Bildern wie diesen für Figurenbau, empfehlen wir, dass das Instrument Betreiber Heatmap Bilder mit der gleichen Biolumineszenz Heatmap (oberer Teil der Abbildung), die visuelle Darstellung des Ausmaßes der Biolumineszenz Unterschied zwischen Tier Themen einzuholen zeigt. <img src="/files/ftp_upload/1986/1986fig3.jpg" alt = "Bild 3" /> Abbildung 3. Biolumineszenz, Überleben und Tumorgewebe Analyse aus einem Experiment, in dem therapeutischen Ansprechen ist evident. A) Plot der mittleren Biolumineszenz Lesungen für die Kontrolle und Behandlung Gruppe Mäuse mit Standardfehler jeweils angegebenen Imaging Punkt. B) Survival Grundstück für gleiche Mäusen; p-Wert durch die Verwendung von Log-Rank-Test 7 bestimmt. C) H & E gefärbten Abschnitt Gehirn der Maus mit Tumor. D) EGFR gefärbte Schnitt. E und F) Vergrößerungen der angegebenen Bereiche aus Platten C und D, jeweils mit Panel E zeigen negative Färbung für Tumor-Suppressor-Protein PTEN.