Labeling und Imaging Cells in der Zebrafisch Hinterhirn
Summary
Schlüssel zum Verständnis der morphogenetischen Prozesse, die der frühe Embryo Form ist die Möglichkeit, Bild-Zellen in hoher Auflösung. Wir beschreiben hier eine Methode zur Kennzeichnung einzelner Zellen oder kleine Gruppen von Zellen in ganzen Zebrafisch-Embryos mit Membran-bezogene Green Fluorescent Protein.
Abstract
Schlüssel zum Verständnis der morphogenetischen Prozesse, die die frühen Wirbeltierembryo Form ist die Möglichkeit, Bild-Zellen in hoher Auflösung. In Zebrafisch-Embryos, Injektion von Plasmid-DNA führt zu Mosaik-Ausdruck, so dass für die Visualisierung von einzelnen Zellen oder kleine Gruppen von Zellen<sup> 1</sup>. Wir beschreiben, wie Injektion von Plasmid-DNA, die Membran-bezogene Green Fluorescent Protein (mGFP) unter der Kontrolle eines ubiquitären Promotor für Imaging-Zellen, die eine Neurulation eingesetzt werden kann. Im Mittelpunkt dieses Protokolls ist die Methode für die Bildgebung markierten Zellen mit hoher Auflösung in Abschnitte und auch in Echtzeit. Das Protokoll beinhaltet die Injektion von DNA in mGFP junge Zebrabärblinge. Die Embryonen werden dann für Vibratom Schneiden, Antikörpermarkierung und Bildgebung mit einem konfokalen Mikroskop verarbeitet. Alternativ können lebende Embryonen zum Ausdruck mGFP aufgenommen mit Zeitraffer-konfokalen Mikroskopie werden. Wir haben früher dieser naive Ansatz verwendet, um die zelluläre Verhaltensweisen, Neuralrohr Bildung Laufwerk im Hinterhirn Region Zebrafischembryonen analysieren<sup> 2</sup>. Die feste Vorbereitungen für beispiellose Visualisierung von Zellformen und Organisation in das Neuralrohr erlaubt während der Live-Bildgebung dieser Ansatz ermöglicht ein besseres Verständnis der zellulären Dynamik, die während Neurulation ergänzt.
Protocol
Discussion
Abschließend beschrieb die Kennzeichnung Techniken hier erlauben einzelne Zelle Analyse von morphogenetischen Prozesse im Zebrafisch Embryo. Der primäre Schwerpunkt dieses Protokoll wird auf Methoden zur Darstellung von markierten Zellen in das Neuralrohr mit mGFP unter der Kontrolle eines ubiquitären Promoters. Weitere Anwendungen dieser transiente Expression Assays sollte sich der Leser zu einer neueren Arbeit von Andersen et al verweisen. 3.
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch ein NIH Zuschuss für R. Brewster (1R01GM085290-01A1) unterstützt.
Materials
Solutions
- Hank’s Stock #1: 8.0 g NaCl , 0.4 g KCl in 100 ml dd H2O
- Hank’s Stock #2: 0.358 g Na2HPO4 Anhydrous, 0.60 g KH2PO4 in 100 ml ddH2O
- Hank’s Stock #4: 0.72 g CaCl2 in 50 ml ddH2O
- Hank’s Stock #5: 1.23 g MgSO4x7H2O in 50 ml dd H2O
- 1 X Phosphate Buffer: 0.8% NaCl, 0.02% KCl, 0.02 M PO4, pH 7.3
- Blocking Solution: 2% normal goat serum, 1% bovine serum albumin (BSA), 1% dimethysulfoxide (DMSO)
Referencias
- Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. . Zebrafish Practical approach series. , (2002).
- Hong, E., Brewster, R. N-cadherin is required for the polarized cell behaviors that drive neurulation in the zebrafish. Development. 133, 3895-3905 (2006).
- Andersen, E., Asuri, N., Clay, M., Halloran, M. Live Imaging of Cell Motility and Actin Cytoskeleton of Individual Neurons and Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos. J Vis Exp. , (2010).
