Электрон Cryotomography бактериальных клеток

I. Подготовка бактериальные культуры клеток Расти бактериальных клеток в нормальном СМИ желаемой фазы в несколько культуральной жидкости мл. Если более высокая концентрация необходима, прядения и ресуспендирования в свежих средств массовой информации могут быть приняты, но не забывайте, что этот процесс иногда вводит структурные изменения в клетках. Проверьте в световой микроскоп, чтобы убедиться, культура свободна от загрязняющих веществ и на соответствующем слияния. Некоторые бактериальные клетки могут палку или даже растут на EM сеток. При выращивании клеток на сетках, золотой сетки с углеродом пальто чаще всего используется, чтобы избежать токсичности для клеток. Они должны быть выписан свечение в течение 2 минут, стерилизовать под ультрафиолетовым светом в течение 15 минут, и помещается непосредственно в культуральной жидкости. Приверженец клетки естественно придерживаться сетки, а другие могут быть предложено присоединиться к сетке покрытия сетки в 0,1% поли-L-лизин в первую очередь. Проверьте сеток в световой микроскоп первых, чтобы убедиться, концентрации клеток уместно перед замораживанием. II. Окунитесь замораживания тонких клеток Для тонких бактериальных клеток, подвеской интактных клеток окунуться замороженных через сетку EM. Процесс сохраняет ультра-структуры клетки бактерий и предотвращает испарение воды в глубоком вакууме ЭМ позже. Это может быть сделано либо с изготовленными на заказ устройства окунуться замораживание, или как мы показываем здесь, с коммерческой автоматического морозильник окунуться, FEI Vitrobot MKIII 4. Тлеющий разряд углерода покрытием EM сетки для 2 – 4 минут. Это делает поверхность сетки гидрофильные, помогая тем самым равномерное распределение образца по всей сетке. Смешайте 100 мкл коллоидный раствор золота (частицы диаметром 10 нм) с 25 мкл 5% концентрированного раствора BSA. BSA пальто частицы золота, и это препятствует их агрегации. Центрифуга BSA и золотые частицы в смеси 18000g в течение 15 минут. После удаления надосадочной, оставшиеся золотые гранулы смешивают с 20 мкл раствора клетки. BSA лечение золотые частицы не взаимодействуют с клетками, но они будут необходимы в качестве исходных точек маркеров для реконструкции томограммы. Применить 4 мкл клеток и смеси золота решение свечение выписан EM сетки в Vitrobot при 100% влажности. Сетка затем автоматически уничтожены с обеих сторон Nr 1 фильтровальной бумаги. Это удаляет лишнюю жидкость, так что только тонкий слой клеток в средствах массовой информации остается. Сетка затем погрузился быстро в жидкую смесь этана и пропана, которая охлаждается примерно до 77 с жидким азотом. Во время этого процесса образец замороженной так быстро, что образование кристаллов льда не имеет возможности в тонких пленках <1 мкм. Осторожно снимите сетку из этан / пропан смеси и быстро перенести в окно сетку хранения данных, которая находится под жидким азотом. III. Высокая Замораживание давления и секционирования Cryo толстые клетки Для более толстых клетки, высокая замерзания давления снижает льда кристаллизации и последующих срезов крио предоставляет образцы достаточно тонкий для EM изображений. 5, 6, 7 Есть много различных держателей образца для замораживания высоких давлений, ваш выбор будет зависеть от того образца, типа замораживания машины используются или следственных выбранной программы. Здесь мы используем Бал-Tec HPM 010 высоким давлением морозильник и крио ультра микротома модель UC6/FC6 от Leica Microsystems. Для бактерий, 15mls счетчик культуры OD> 0,5 берется непосредственно из 37 ° C инкубатора и центрифугировали при 1000rpm в течение 3 минут. После удаления надосадочной, смешать 0,5 мл остальные культуры гранул с 0,5 мл 20% криопротектора декстран, а затем центрифуге при 13000rpm течение 15 секунд. После удаления надосадочной, пипетки 0,1 мл из супер гранул вставить в термосварного микропипетки кончик, который уже содержит 0,2 мл 20% декстран cryoprotecant (40000Mwt). Центрифуга смеси в микропипетки наконечник при 13000 оборотов в минуту в течение 30 секунд и удалите супернатант. 5-10 мкл жесткие гранулы замечен в запечатанном чаевые. "Тефлоновый" покрыты медными куполами Планше готовы установлен в высокой руке морозильник держатель давление получает пасту в одной половине куполом и запечатывается с плоской шляпкой латуни партнера. Рука сборка затем быстро вставляется в загрунтовать высоким давлением готовы морозильник для замораживания. В 2100 бар давлением комбинированной установки Планше латунь содержащая клетки быстро охлаждается струей высокого давления жидкого азота, снимая руку сборки мгновенно и погрузиться в ванну с жидким азотом, предотвращает Планше от потепления. Планше единицы хранятся в жидком азоте до необходимого для крио-срезов. Чтобы разоблачить хорошо замороженное купол клетки для секционирования, два planchets латуни тщательно отделить недеформированнойт жидкого азота. Прекрасно замороженных купол клеток стеклообразных по внешнему виду, без трещин и трещин льда нуклеации. Это Планше передается предварительно охлажденном -170 ° C камеры и надежно закреплен на крио-микротома вице-подобный патрон. Охлаждением cryomicrotome содержит эфирные cryotools необходимые для секционирования, к ним относятся: низкий угол крио-алмаз нож, алмазный инструмент обрезки, нажмите платформы, коробка сетки хранения, антистатик-спрей устройства и сетки проведение аппарата. Для успешной лентой секционирования внешней области купола первоначально форму до <0,2 мм квадрат алмаз обрезки инструмента и быстрой скоростью секционирования, сохраняя при ~ 200 мкм глубина и замороженных периметру. С антистатические аэрозоли, направленных на низких ножом угол и меди поддержки сетки в непосредственной близости, нож алмаз тщательно подошел к полированной лице блока готовят к секционирования. Микротом параметры выбираются, такие как настройка разделе толщиной от 50 до 350 нм, а также скорости резания ~ 0.4mm/sec и узкое окно резки. Важно контролировать антистатические спектр распыления и интенсивности условиях низкой влажности воздуха в непосредственной близости. В качестве первого раздела производится тонкой аппликатор ресница перемещаются с помощью рук или микроманипулятора поймать предыдущих разделах соскальзывания низким углом алмаза лезвие ножа. Хотя лента секций вынуждены отказаться от ножа, они нежно поддерживают ресниц зонд и руководствуясь через поддержку медную сетку рядом. Чтобы придерживаться разделов, сетку загружается с лентами, затем плотно прижимается использованием охлажденной полированного серебра зонд, некоторые разделы так высоко заряженных последние антистатических устройствах может помочь в спаечный процесс. Сетка ящики хранятся в течение длительного хранения в жидком азоте охлаждением сухим грузоотправителя до микроскоп готов к сетке передаче. IV. Изучение клеток с использованием микроскопа Cryo Света Бактериальные клетки на сетке могут быть отображены использованием микроскопа крио света (cryoLM). Микроскоп мы используем здесь обычай Nikon инвертированным микроскопом Ti E / B с удлиненным рабочим расстоянием (ELWD) 60x воздуха объектив. Сетки находятся в стадии крио во время съемки, которая представляет собой модифицированную FEI крб для светового микроскопа. Использование поиска сетке, клетки могут располагаться на сетке квадратов и cryoLM изображений быть соотнесена с cryoEM томограммы. Нагрузка сетки в патроны на крио-станции. Картриджи пользовательские изменения от наших стандартных картриджей для EM FEI TF30H-Polara. Сетка удерживается кольцами медного клипа. Картридж затем хранится в трубке в жидком азоте для передачи. Прохладный этапе крио до температуры жидкого азота (-190 ° C). Нагрузка картридж в стадии крио и переместить сетку в окне просмотра. Этапе может вместить до двух пользовательских изменение картриджей. Нижний конденсатор линз и сосредоточиться 60x объектив на сетке. Найти клетки и получать изображения. Для коррелировали Л. М. и Е. М. исследование, сетка сканируется в районе клеток, для определения местонахождения клетки позже в EM. После визуализации сетки, положите картридж обратно в трубу и держать трубку в жидком азоте до готовности для включения в образ в EM. В. Сбор Tilt серии в Cryo TEM Для получения 3D томограмму бактериальной клетки, серия проекции изображения взяты в то время как образец постепенно наклонена по одной или двум осям в крио ПЭМ. С учетом угла наклона и других экспериментальных условиях, Есть несколько различных программное обеспечение для автоматического сбора наклона серии. Мы используем для наших Leginon крио ТЕМ который FEI TF30H-Polara. Он позволяет автоматически принимать наклона серии предварительно клетки 8. Загрузите патроны в множественный выбор держателя (МСГ) на предварительно охлажденном станции крио. MSH может вместить до 6 патронов. Подключение к MSH TF30H-Polara, выбрать один патрон и вставить его в колонке EM. Начало Leginon-клиент на компьютер и Е. М. Leginon основной программы на другие станции. Настройка предустановок (изображение условий) для Leginon сессии. Важными параметрами являются увеличение, фокус под значение, электрон дозы и углов наклона для наклона серии, включая начальный угол, конечный угол и шагом. Выберите целей на изображения, начиная с самого низкого увеличения и отправить их на следующий шаг с большим увеличением. Очередь все цели наклона серии сбор и представить все из них в финал "томографии" шаг. Процесс сбора данных можно контролировать через веб-инструмент из локальной рабочей станции. После экспериментального сбора данных не будет сделано, внизнагрузки завершены наклона серии на локальной рабочей станции на реконструкцию. VI. Биобезопасности соображений Большинство биологических образцов, с которыми мы работаем не являются патогенными и были выделены из почвы, водопроводную воду или кишечника насекомых. Основные асептики достаточно для обработки этих образцов. Работа с возбудителями требует осуществления дополнительных мер безопасности, однако для экстремальных опасностей, некоторые лаборатории установили всей крио-ЭМ микроскопы в BSL-3 лаборатории. Ниже приводятся некоторые способы, которыми мы снизили риск работы с патогенами в нашей лаборатории. Патогенность образец может быть ослаблен ни химически, ни генетически. Многие лаборатории делают крио-ЭМ вирусов инактивированной их с химическими фиксаторов до окунуться заморозки. В качестве альтернативы, ключевые мутации могут быть введены, которые делают образцы неинфекционных, включая, например, инактивации точечные мутации в определенных ферментов или выбивания рецепторов. Средства индивидуальной защиты, такие как перчатки, лабораторный халат и защитные очки нужно носить. Опасных проб могут быть обработаны в кабинет биобезопасности (BSC). Бактериальных культур можно выращивать, сконцентрированы, и даже окунуться заморозки на EM сеток в BSC. У нас есть меньше, ручной окунуться заморозки устройство, которое вписывается в нашу BSC для этой цели. Если большую последовательность предлагаемых автоматического окунуться-морозильники необходимы, они могут быть либо введены в BSC, или, проще говоря, в некоторых случаях мы поддержали промокательной прокладки нашего Vitrobot с алюминиевой фольгой, чтобы предотвратить загрязнение устройства. При работе с BSC, так как многие из инструментов и материалов, а возможно будет в или из шкафа следует дезинфицировать с 70% этанола. При подготовке нашей сети, мы используем небольшие объемы бактериальной или вирусной культуры (обычно 4 мкл), большинство из которых получает уничтожены на ватмане. Промокательной бумаги, наконечники, а остальные культуры уничтожены как биологически опасные отходы. Все инструменты и открытые поверхности дезинфицируют разбавленной хлорной извести, 95% этанола и воды. После сетки заморожены, они хранятся при температуре жидкого азота всей коллекции хранения и управления данными. Было показано, что клетки могут выжить замораживания и оттаивания, то, хотя, так что мы продолжаем относиться к ним как опасные всей коллекции хранения и управления данными. В конце сбора данных, баллончиков, содержащих замороженные сетки удаляются из крио-TEM и упал прямо в 70% спирте. Хотя редко, следует отметить, что иногда сетки "упал" в столбце, а последствия такого мероприятия должно быть предусмотрено для каждого опасного образца. Большинство микроскопа при комнатной температуре, поэтому пробы на сетку упал, скорее всего, оттепели в колонну и стали полностью высушенный в сверхвысоком вакууме ЭМ. Это, очевидно, инактивирует некоторые биологические образцы, но, возможно, не надежная вирусов и сухие остатки образцов потенциально могут быть выпущены в виде аэрозолей, когда микроскоп колонке рядом открыт для обслуживания. VII. Томограммы реконструкции Томограммы бактериальные клетки восстанавливаются с помощью программного обеспечения. Есть несколько программное обеспечение, доступное для этой работы. Мы используем Raptor для автоматической реконструкции и скрининга томограммы. 9 Как автоматическое выравнивание серии наклона и последующей реконструкции является нетривиальной задачей, Raptor настоящее время не имеет 100% успеха. В случае отказа или Raptor необходимость обеспечения высокого качества реконструкции, мы используем ручной выравнивания изображений и реконструкции с eTomo в комплект программного обеспечения томографии IMOD. 10, 11 Скачать каждой отдельной серии наклона от локальный веб-сервер Leginon. Сохранить их в каталог, где они легко могут быть расположены. Вручную проверять наклона серии использовании 3dmod зрителя IMOD и отбросить те, когда Leginon не удалось отслеживания цели или производить полезную серии наклона. Бежим Raptor распределены по Linux машин в лабораторию через Персик (Перл-системы для распределять задачи по сети). Мы определяем размер нашей доверительное маркеры, т.е. коллоидных частиц золота, количество маркеров, которые будут использоваться для реконструкции, пиксел размера, нужной толщины реконструкции, биннинга фактор и ряд основных параметров (таких как вход, Выход пути и формат вывода) в командной строке и оставить его работать, как правило, 20 минут до 2 часов для 122-изображений набора данных (2k на 2k). Если вы согласны с реконструкцией результате, ступени ниже в этом разделе, могут быть пропущены. При ручной реконструкция необходима, переименовывать файлы из папки ". MRC" до ". Го" и загрузить отдельные серии наклона в eTomo GUI в свите томографии IMOD. Укажите наклона оси серии типа (с одним или двумя осями) и введите координатных размеров используются в саmple подготовки. Сканирование заголовка файла, чтобы определить размер пикселя, и перейти, нажав кнопку "Создать Com скрипты". Следуйте инструкциям каждой вкладки в eTomo GUI для реконструкции томограммы от наклона серии. Проверьте и убедитесь, результат после каждого шага, а если не устраивает, всегда можно вернуться к любой предыдущий шаг и перерабатывать оттуда. "Предварительная обработка" является проведение подготовительных обработки и удаления аномально высокой интенсивности пикселей вызванных Х-лучами. "Грубое выравнивание» выпускает серию наклона которой каждое последующее изображение проекции в серии наклона выравнивается по предыдущей перекрестной корреляции. Мы определяем которые золотым бисером для использования в качестве fiducials в "Исходные поколения модели", и программа отслеживает доверительное маркеры в каждой проекции изображения и строит «Изобразительное Выравнивание". "Томограмма Позиционирование" позволяет обрезка томограммы в Z. "Окончательное неприсоединения Стек" создан с помощью линейной интерполяции, а также такие функции, как CTF-коррекция, Gold-ластик и 2D-фильтрации может быть применен дополнительно. Томограмма рассчитывается в "Создать томограмму" с помощью взвешенных обратно-проекции в фурье-пространстве. "Пост-обработка" позволяет обрезки томограмма на XY-области интереса и масштабирование контрастность в диапазоне от структур интерес, и "Очистить" удаляет промежуточные файлы и освобождает место на диске. VIII. Хранение Томограммы в Базе Данных Мы используем веб-внутренние базы данных для организации, хранения, поиска и распространения томографических данных. Для каждого наклона серии, мы можем записать образец детали, параметры микроскопа коллекции, сырье серии наклона, а также связанного 3D-реконструкция и других файлов обработки. Главная страница просматривают представляет эскиз и признакам "YouTube", как фильм для каждого томограмма, и записи могут быть организованы скачать частоты, создатель, типа образца или дате. Пользователи могут искать базу данных, введя ключевые слова или особенностей. В настоящее время более 4500 томографических наклона серии будут сданы на хранение в базе данных, охватывающих почти 60 видов видов / образец, при этом в общей сложности более 11 000 связанных с ними файлов. IX. Анализ и сегментация Томограммы Детали строения томограммы можно просмотреть и проанализировать с помощью различного программного обеспечения обработки изображений с инструментами, например 3dmod зрителя IMOD с ZAP, XYZ и среза окна. Следующим шагом является создание сегментация 3D-изображения (томограмма). Сегментация присваивает каждому воксела (объемных пикселей) 3D-изображение этикетке описания в каком регионе или материал воксела принадлежит, например, мембраны или цитоскелета. Мы используем программные инструменты, такие как 3dmod в IMOD и Амира (Visage Imaging). Хотя некоторые программные средства обеспечивают автоматическую сегментацию модулей (например, порог сегментации), они часто работают только для изображений с высоким контрастом. 3D изображения основе низких доз электронно cryotomography такой низкой контрастностью, что в большинстве случаев нам приходится вручную назначить метку каждого воксела. Сегментация хранится в отдельном файле данных. Он может быть использован для создания поверхности модели, в которой каждый регион показан с другим цветом и просмотреть в 3D. Томограммах могут быть использованы для других видов анализа. Например, соответствующий шаблон и последующего расчета может дать статистическую информацию о макромолекулярных комплекса, таких как рибосомы. Подтома выравнивание и усреднение показывает структур в более высокую контрастность и раскрывает тонкости. X. Создание фильмов основанных на томограммах Мы делаем фильмы для обобщения каждому проекту и дать визуальную экскурсию по нашей томографических изображений. Сделать сценарий особенности в данных, которые мы хотели бы показать и как сделать эти функции. Например, в типичном фильме цельноклеточная томографии проекта, мы начинаем, показывая репрезентативные данные серии наклона и затем следовать с ломтиком-на-фрагментного зрения реконструированные томограммы. Далее, мы показываем сегментации ключевых макромолекул в клетку, например, жгутиковых двигателя или хеморецепторов сложных или цитозольного нити. Наконец, мы заключаем с модель, показывающая идеализированные интерпретации макромолекул мы изучаем. Графика представление программы, такие как Амира или Химера использовать для визуализации отдельных кадры из фильма. Мы обычно собирают фильмы из коротких клипов для облегчения изменения каждого клипа. Использование коммерческого кино программное обеспечение для редактирования, такие как Adobe Premiere собрать кадры в видеоклипов, а затем видеоклипов в финальный ролик. Мы начали добавлять аудио трек, который повествует фильм. Повествование действует как "фильм легенда» и позволяет зрителям сосредоточиться на данные, представленные во время просмотра фильма. XI. Анимация Визуальныйповествование сообщает знания, не требуя комплекс словарь конкретных научных областях. Трудные понятия становятся простыми в сопровождении наглядной демонстрации. Практика иллюстрирующие биологические идеи с карикатурами, не нова. Однако только в последнее десятилетие, сложные инструменты профессиональных 3D создания контента было пущено в ход на себя задачу построения научных анимации. Есть в настоящее время десятки исследователей активно переводить биологических системах на динамические 3D анимации. Много красивых анимаций продемонстрированы на http://MolecularMovies.org . Этот сайт также содержит учебные пособия и раздает бесплатный набор инструментов для работы с молекулярными структурами в Autodesk Maya. С открытым исходным кодом 3D-контента для новобрачных, Blender, содержит несколько пользователями PDB импортеров. Процесс создания 3D-анимации обычно включает в себя три этапа: Моделирование: Мы используем графики представления программного обеспечения на экспорт поверхностей в форматах, которые можно импортировать в Maya. Эти поверхности являются либо сегментации из реконструированных томограммы, например, мембран, гранулы, или нитей, или представления молекулярных поверхностей. Томограмма сегментации осуществляется в Amira; молекулярных поверхностей генерируются в Химера или VMD. Атомная представлениям молекулы могут быть импортированы непосредственно в Maya из PDB-файлов. Как только модели в Maya, они могут быть изменены, скопированы, и позиционируется как это необходимо. Анимация: Анимация традиционно построенный вручную, с художником вручную перемещения подвижных объектов и записи ряда ключевых кадров. Новые достижения в области 3D графического программного обеспечения в настоящее время позволяют динамики, которые будут созданы процедурно, с помощью встроенных модулей и сценариев API. Оказание: Процедурные динамика может предоставить убедительные анимации динамических биологических процессов, таких как структурные самостоятельной сборки. Однако из-за трудностей реалистично моделирования биологических систем, большинство 3D-анимации по-прежнему построен с использованием традиционных методов ключевым кадром. После динамики в порядке, визуальные аннотации, текстур и эффектов освещения могут быть добавлены. Наконец, камера путь избрал и завершили анимации осуществляется с помощью кино.