Electron Cryotomography de las células bacterianas

I. Preparación del cultivo celular bacteriana Crecen las células bacterianas en sus medios normales de fase deseado en una cultura ml de líquido pocas. Si es necesaria una mayor concentración, el hilado y la resuspensión en medio fresco puede ser adoptado, pero tenga en cuenta que este proceso a veces se introducen cambios estructurales en las células. Verificación en el microscopio de luz para asegurarse de que la cultura es libre de contaminantes y en una confluencia apropiado. Algunas células bacterianas se pueden pegar o incluso crecer en las redes de EM. Cuando las células que crecen en las redes, las redes de oro con una capa de carbono son los más utilizados para evitar la toxicidad a las células. Deben ser dados de alta luz durante 2 minutos, esterilizados bajo una luz ultravioleta durante 15 minutos, y se coloca directamente en el cultivo líquido. Células adheridas naturalmente se adhieren a la red, y otros pueden ser impulsados ​​a adherirse a la red mediante el recubrimiento de la red en el 0,1% de poli-L-lisina en primer lugar. Compruebe las rejillas en el microscopio óptico primero para asegurarse de que la concentración de células es apropiado antes de la congelación. II. Sumérgete delgada congelar células De finas células bacterianas, la suspensión de células intactas se hunden congelados a través de una red de EM. El proceso conserva la estructura ultra-de las células de las bacterias y evitar la evaporación del agua en el alto vacío de la EM más tarde. Se puede hacer ya sea con productos a medida caída de congelación, o 4 como se muestra aquí, con un congelador caída automática comercial, FEI Vitrobot MKIII. Descarga luminiscente de la cubierta de carbono EM red de 2 a 4 minutos. Esto hace que la superficie de la parrilla hidrofílico, lo que ayuda para repartir uniformemente la muestra a través de toda la red. Mezclar 100μl solución de oro coloidal (diámetro de partícula de 10 nm) con 25μl de una solución al 5% se concentró BSA. Las capas de BSA las partículas de oro y esto impide su agregación. Se centrifuga la BSA y la mezcla de partículas de oro en 18000g durante 15 minutos. Después de retirar el sobrenadante, el pellet restante oro se mezcla con 20 l solución de células. La BSA tratados partículas de oro no reacciona con las células, pero será necesario que los marcadores de referencia para la reconstrucción de las tomografías. Aplicar 4 l de la célula y la mezcla de solución de oro a la luz dados de alta en la red de EM Vitrobot al 100% de humedad. La rejilla es automáticamente borrado de ambos lados con papel de filtro N º 1. Esto elimina el exceso de líquido, de modo que sólo una fina capa de células en sus medios de comunicación sigue siendo. La red es luego cayó rápidamente en una mezcla líquida de etano y propano que se enfría a aproximadamente 77K con nitrógeno líquido. Durante este proceso, la muestra se congela tan rápidamente que la formación de cristales de hielo se evita en películas delgadas <1 micra. Retire con cuidado la rejilla de la mezcla de etano / propano y transferir rápidamente en una caja de almacenamiento de red que se guarda en nitrógeno líquido. III. La congelación de alta presión y Cryo La sección del grueso células Para más gruesas las células, la congelación de alta presión reduce la cristalización del hielo y el posterior corte crio hace muestras lo suficientemente delgada como para la EM de imágenes. 5, 6, 7 Hay muchos titulares de muestra disponibles para la congelación de alta presión, la selección dependerá de la muestra, el tipo de máquina de congelación utilizado o se selecciona la aplicación de investigación. Aquí se utiliza Bal-Tec HPM 010 congelador de alta presión y crio de ultra micrótomo modelo UC6/FC6 de Leica Microsystems. Para las bacterias, 15mls spinner cultura de DO> 0,5 se toma directamente de la incubadora a 37 ° C y se centrifuga a 1000 rpm durante 3 minutos. Después de retirar 0,5 ml sobrenadante, mezcla de la cultura queda precipitado con 0,5 ml de 20% de dextrano crioprotector y luego centrifugar a 13000rpm durante 15 segundos. Después de eliminar el sobrenadante, 0,1 ml pipeta de los pellets de súper pegar en punta de la micropipeta con sellado térmico, que ya contiene 0,2 ml de 20% de dextrano cryoprotecant (40000Mwt). Centrifugar la mezcla en la punta de la micropipeta a 13000 rpm durante 30 segundos y eliminar el sobrenadante. A 5.10 l apretado pellet se ve en el extremo cerrado. A "teflón" de bronce con su cúpula cubierta montada plancheta listo en el brazo de soporte de alta presión congelador recibe la pasta en una media cúpula y se sella con su sombrero plano de bronce pareja. El conjunto del brazo se inserta rápidamente en el congelador la presión alta preparado listo para congelar. 2100 bar de presión de la unidad de tubos y plancheta combinados que contienen las células se enfría rápidamente por un chorro de nitrógeno líquido de alta presión, la eliminación del conjunto de brazo de forma instantánea y sumergirse en un baño de nitrógeno líquido impide que la plancheta de calentamiento. Unidades de Planchet se almacenan en nitrógeno líquido hasta su utilización para la crio-cortes. Para exponer la cúpula y congelado de células para el corte, los dos cospeles de cobre se separan cuidadosamente under de nitrógeno líquido. La cúpula perfectamente congelada de células tiene aspecto vítreo, libre de grietas y fisuras de hielo nucleación. Esta plancheta se transfiere a un pre-enfriado -170 ° C y la cámara montada de forma segura en la crio-microtomo vice-como Chuck. El criomicrotomo enfriado contiene cryotools esenciales necesarios para el corte, estos incluyen: un ángulo bajo de la crio-diamante cuchillo, una herramienta de diamante de corte, la plataforma de prensa, caja de almacenamiento de red, una unidad de spray anti-estática y un aparato de red de explotación. Para el corte de cinta con éxito una región cúpula exterior se encuentra inicialmente en forma de cuadrado <0,2 mm por la herramienta de diamante de corte y una velocidad de corte rápido, manteniendo la profundidad de ~ 200μm de perímetro y congelados. Con el spray antiestático dirigida a la cuchilla de ángulo bajo y las redes de cobre de apoyo de proximidad, la cuchilla de diamante es cuidado a la cara del bloque pulido preparado para el corte. Parámetros microtomo son elegidos, como un ajuste de espesor de corte entre 50 y 350 nm, con una velocidad de corte de ~ 0.4mm/sec y la ventana de corte estrecho. Es importante controlar el rango de spray antiestático y la intensidad de las condiciones de baja humedad en el área inmediata. Como los primeros tramos se producen un aplicador de las pestañas bien se maneja con la mano o micromanipulador para enganchar las primeras secciones de deslizamiento fuera del diamante de bajo ángulo de filo de la navaja. Mientras que la cinta de las secciones es forzado a abandonar el cuchillo, que son suavemente con el apoyo de una sonda de pestañas y guiado a través del apoyo a la red de cobre cercanas. Para seguir las secciones, la red de carga con cintas luego se presiona firmemente con un enfriado pulido de plata de la sonda, algunas secciones están tan cargadas con los últimos dispositivos antiestáticos puede ayudar en el proceso de adhesión. Cuadrículas se mantienen para el almacenamiento a largo plazo en nitrógeno líquido refrigerado cargador seco hasta que el microscopio está listo para la transferencia de la red. IV. Se examinan las células con el microscopio de luz Cryo Las células bacterianas en la red se pueden obtener imágenes con un microscopio de luz crio (cryoLM). El microscopio se utiliza aquí es una costumbre microscopio invertido Nikon Ti E / B con la distancia de trabajo extra largo (ELWD) aire 60x lente del objetivo. Las rejillas se mantienen en una etapa criogénica durante la exploración, que es una modificación del FEI etapa criogénica de microscopio de luz. El uso de un buscador de la red, las células pueden estar situados en las cuadrículas y las imágenes cryoLM estar correlacionado con la tomografías cryoEM. De carga en las redes de cartuchos en la crio-estación. Los cartuchos son modificados a medida de nuestro cartucho estándar de EM de la FEI TF30H-Polara. La red se lleva a cabo por los anillos de clip de cobre. El cartucho se guardan en un tubo de nitrógeno líquido para la transferencia. Enfriar la etapa criogénica hasta la temperatura del nitrógeno líquido (-190 ° C). Cargar el cartucho en la etapa criogénica y mover la cuadrícula en la ventana de visualización. El escenario tiene capacidad para dos cartuchos a medida modificada. Inferior de la lente condensadora y el enfoque de la lente del objetivo 60x en la red. Encuentra las células y tomar imágenes. Por LM correlacionados y el estudio de EM, la red es analizado en el área de las células, para la localización de las células después de EM. Después de la filmación de la red, poner el cartucho en el tubo y mantener el tubo en nitrógeno líquido hasta que esté listo para ser captado en EM. V. Recopilar la serie de inclinación en el TEM Cryo Para obtener una tomografía en 3D de la célula bacteriana, una serie de imágenes de proyección se toman mientras la muestra se inclina progresivamente a lo largo de uno o dos ejes en el TEM crio. Teniendo en cuenta los ángulos de inclinación y de otros parámetros experimentales, hay varios programas diferentes disponibles para recopilar automáticamente la serie de inclinación. Utilizamos para nuestros Leginon TEM crio que se FEI TF30H-Polara. Que permite tomar automáticamente series de inclinación de las células preseleccionadas 8. La carga de los cartuchos en el soporte de multi-selección (MSH) en la estación de pre-enfriado crio. La MSH tiene capacidad para 6 cartuchos. Conecte el MSH a la TF30H-Polara, elige un cartucho e insertarlo en la columna de la EM. Inicio Leginon-cliente en el equipo y el programa EM Leginon principal de la estación de trabajo. Establecer presets (condiciones de la imagen) para una sesión de Leginon. Los parámetros importantes son la ampliación, el valor se centran en la dosis de electrones y los ángulos de inclinación para inclinar la serie, incluyendo el ángulo de partida, el ángulo final y los incrementos. Recoger los objetivos de las imágenes a partir de el aumento más bajo y los envían a la etapa siguiente con un aumento mayor. Cola todos los objetivos para la recolección de la inclinación de la serie y presentar todos ellos a la final de "tomografía" paso. El proceso de recopilación de datos pueden ser monitoreados a través de la herramienta web de una estación de trabajo local. Después de la recogida de datos experimentales se hace, porcargar la planilla de inclinación de la serie en una estación de trabajo local para la reconstrucción. VI. Bioseguridad consideraciones La mayoría de las muestras biológicas con las que trabajamos son no patógenas y han sido aislados de la tierra, el agua del grifo o en el intestino de los insectos. Técnicas de asepsia básica es suficiente para el manejo de estas muestras. Trabajar con agentes patógenos requiere de la implementación de medidas de seguridad adicionales, sin embargo los peligros extremos, algunos laboratorios han instalado toda la crio-ME microscopios en los laboratorios BSL-3. Las siguientes son algunas de las formas en que han reducido el riesgo de trabajar con agentes patógenos en el laboratorio. La patogenicidad de una muestra puede ser atenuada ya sea química o genéticamente. Muchos laboratorios haciendo la crio-ME del virus han inactivado con fijadores químicos antes de la caída del punto de congelación. Como alternativa, las mutaciones se pueden introducir claves que hacen que las muestras no infecciosas, incluyendo, por ejemplo, la inactivación de las mutaciones puntuales en ciertas enzimas o la anulación de los receptores. Equipo de protección personal como guantes, bata y gafas de protección deben ser usados. Las muestras peligrosas se pueden manejar en un gabinete de bioseguridad (BSC). Cultivos de bacterias pueden ser cultivadas, concentrada, e incluso de inmersión congelados en las redes de EM en el BSC. Tenemos un pequeño, manual de inmersión congelación dispositivo que cabe en nuestro BSC para este propósito. Si la mayor consistencia que ofrece automático de inmersión congeladores que se necesita, que puede ser introducido en el BSC, o, más simplemente, en algunos casos, hemos apoyado las pastillas de borrar de nuestra Vitrobot con papel de aluminio para evitar la contaminación del producto. Cuando se trabaja con un BSC, ya que muchas de las herramientas y materiales como sea posible ir dentro o fuera del gabinete deben ser desinfectados con etanol 70%. En la preparación de nuestras redes, que utilizan pequeñas cantidades de un cultivo bacteriano o viral (generalmente 4 ul), la mayoría de los cuales se borró por el papel Whatman. El papel secante, puntas de pipeta, y la cultura restantes son eliminados como residuos biológicos peligrosos. Todas las herramientas y las superficies expuestas son desinfectadas con lejía diluida, el 95% de etanol y agua. Una vez que las rejillas se congelan, se mantienen a temperaturas de nitrógeno líquido durante la recogida de datos y almacenamiento. Se ha demostrado que las células pueden sobrevivir a la congelación y descongelación entonces, sin embargo, por lo que continuamos a tratarlos como peligrosos a lo largo de la colección de datos y almacenamiento. Al final de la recolección de datos, que contienen los cartuchos de las redes de congelados se eliminan de la crio-TEM y cayó directamente en alcohol al 70%. Aunque es poco común, debe tenerse en cuenta que a veces las redes se "cayó" en la columna, y las consecuencias de tal evento se debe contemplar para cada muestra peligrosos. La mayoría de los microscopios es a temperatura ambiente, por lo que la muestra en una cuadrícula cayó probablemente descongelar dentro de la columna y se convierten en totalmente desecado en el vacío ultra-alto de la EM. Esto, obviamente, desactivar algunas muestras biológicas, pero quizás no los virus resistente, y los restos disecados de la muestra podría ser liberado en forma de aerosoles en la columna del microscopio se encuentra al lado abierto para el servicio. VII. Tomografía Reconstrucción El tomografías de las células bacterianas se reconstruyen a través de software. Hay varios programas disponibles para este trabajo. Usamos Raptor para la reconstrucción automática de detección y tomografías. 9 Como alineación automática serie de inclinación y la posterior reconstrucción es una tarea no trivial, el Raptor no tiene actualmente una tasa de éxito del 100%. En el caso de un fallo Raptor o la necesidad de una reconstrucción de alta calidad, utilizar la alineación manual de la imagen y la reconstrucción con eTomo en la suite de software IMOD tomografía. 10, 11 Descarga de cada serie de inclinación individuales desde el servidor web Leginon local. Guardarlos en un directorio donde se pueden localizar fácilmente. Inspeccionar manualmente la serie de inclinación con el Visor de 3dmod IMOD y descartar aquellos que Leginon ha fallado el seguimiento de la meta o la producción de una serie de inclinación útil. Corremos Raptor distribuidos en las máquinas Linux en el laboratorio a través de melocotón (un sistema basado en Pearl-para distribuir las tareas en una red). Se especifica el tamaño de nuestros marcadores de referencia, es decir, las partículas de oro coloidal, el número de marcadores que se utilizan para la reconstrucción, el tamaño de píxel, el grosor deseado de la reconstrucción, el factor de binning y una serie de ajustes básicos (por ejemplo, de entrada, rutas de salida y el formato de salida) en la línea de comandos y dejar que se ejecute, por lo general 20 minutos a 2 horas por un 122-imagen-conjunto de datos (2k por 2k). Si está satisfecho con el resultado de la reconstrucción, los pasos siguientes en esta sección se puede omitir. Cuando la reconstrucción manual es necesario, cambiar el nombre de los archivos de ". MRC" a ". St" y carga de la serie de inclinación individuales en la interfaz gráfica de usuario eTomo en la sala de tomografía IMOD. Especificar la serie de inclinación tipo de eje (eje simple o doble), e introduzca el tamaño fiduciales utilizados en sapreparación MPLE. Busque en la cabecera del archivo para determinar el tamaño de píxel, y proceder haciendo clic en "Crear scripts Com". Siga los pasos de cada pestaña en la interfaz gráfica de usuario eTomo para reconstruir la tomografía de la serie de inclinación. Inspeccionar y verificar el resultado después de cada paso, y si no está satisfecho, siempre podemos volver a cualquier paso anterior y repite el proceso desde allí. "Pre-procesamiento" es para realizar el proceso de preparación y eliminar anormalmente alta intensidad píxeles causados ​​por rayos-X. "Alineación aproximada" produce una serie de inclinación en el que cada imagen de proyección posterior en la serie de inclinación se alinea a la anterior por la correlación cruzada. Se define que las cuentas de oro para su uso como fiduciales en "Generación de modelos de Fiducial", y el programa de seguimiento de los marcadores de referencia en cada imagen de proyección y construye "ajuste fino". "Colocación de tomografía" permite recortar la tomografía en Z. "Pila final Alineados" se genera mediante la interpolación lineal, y funciones como CTF-corrección, de oro Eraser y 2D de filtrado se puede aplicar de forma opcional. La tomografía se calcula en "Generar tomografía" por peso de retroproyección en el espacio de Fourier. "Post-procesamiento" permite los cultivos de la tomografía a la XY-región de interés y la ampliación de la diferencia en el rango de las estructuras de interés, y "A Limpiar" borra los archivos intermedios y libera el espacio en disco. VIII. El almacenamiento de la base de datos de tomografías Utilizamos una red basada en la base de datos interna para organizar, almacenar, buscar y distribuir los datos tomográficos. Para cada serie de inclinación, se puede registrar los detalles de la muestra, los parámetros de microscopio de colección, serie inclinación primas, así como asociados de reconstrucción 3D y otros archivos de procesamiento. La página principal del navegador presenta una imagen en miniatura y un destacado "YouTube", como de película para cada tomografía, y las entradas pueden ser organizados por la frecuencia de descarga, creador tipo de muestra, o la fecha. Los usuarios pueden buscar en la base de datos mediante la introducción de palabras clave o características especiales. En la actualidad más de 4.500 series de inclinación tomografía han sido depositados en la base de datos, cubriendo cerca de 60 tipos de especies / muestras, con un total de más de 11.000 archivos asociados. IX. Análisis y segmentación de la tomografías Los detalles estructurales de las tomografías pueden ser vistos y analizados a través de diferentes programas informáticos con herramientas de procesamiento de imágenes, visor, por ejemplo 3dmod de IMOD con ZAP, XYZ y la ventana de máquina de cortar. El siguiente paso es crear una segmentación de la imagen 3D (tomografía). Una segmentación asigna a cada voxel (pixel volumétrica) de la imagen 3D una etiqueta que describe a la región o el material del voxel pertenece, por ejemplo, una membrana o un citoesqueleto. Utilizamos herramientas de software como 3dmod en IMOD y Amira (Visage Imaging). Aunque algunas de las herramientas de software ofrecen módulos automáticos de segmentación (por ejemplo, la segmentación del umbral), que a menudo sólo trabajan para las imágenes con alto contraste. Las imágenes en 3D derivados de cryotomography de electrones de baja dosis con un contraste tan baja que en la mayoría de los casos tenemos que asignar manualmente una etiqueta a cada voxel. La segmentación se almacena en un archivo de datos. Puede ser utilizado para generar un modelo de superficie en la que se muestra cada región con un color diferente y ver en 3D. El tomografías puede ser utilizado para otros análisis. Por ejemplo, haciendo coincidir la plantilla y el cálculo posterior puede proporcionar información estadística de los complejos macromoleculares como los ribosomas. La alineación y un promedio de volumen secundario muestra las estructuras de mayor contraste y revela los detalles más finos. X. Hacer películas basadas en las tomografías Hacemos películas para resumir cada proyecto y para dar un recorrido visual de nuestras imágenes tomográficas. Hacer un script de las características de los datos que desea mostrar y el modo de hacer esas características. Por ejemplo, en una película típica de un proyecto de tomografía de células enteras, se comienza por mostrar una inclinación de datos representativos serie y luego seguir con el fin de corte por parte de la tomografía reconstruido. A continuación, se muestra una segmentación de las macromoléculas clave en la célula, por ejemplo, un motor flagelar o un complejo de los quimiorreceptores o un filamento citosólica. Finalmente, se concluye con un modelo que muestra una interpretación idealizada de las macromoléculas que estamos estudiando. Software de gráficos de representación, como Amira o Quimera se utilizan para representar los cuadros individuales todavía de la película. Por lo general montar las películas de clips más cortos para facilitar los cambios a cada clip. Utilice el software de edición de películas comerciales como Adobe Premiere para montar los cuadros aún en clips de película, y luego los clips de película en la película final. Hemos empezado a añadir una pista de audio que narra la película. La narración actúa como una "leyenda de cine" y permite al público a centrarse en los datos que se presentan mientras se ve la película. XI. Animación Visualla narración se comunica el conocimiento sin necesidad de un vocabulario complejo de determinados campos científicos. Conceptos difíciles se convierten en simples cuando se acompaña de la demostración visual. La práctica de ilustrar las ideas biológicas con los dibujos animados no es nueva. Sin embargo, sólo en la última década con las herramientas sofisticadas de la creación de contenido profesional 3D sido usada para perseguir a la tarea de construir animaciones científicas. Ahora hay docenas de investigadores activamente la traducción de los sistemas biológicos en dinámicas animaciones 3D. Muchas bellas animaciones se exhiben en http://MolecularMovies.org . Ese sitio alberga también tutoriales y distribuye un conjunto de herramientas libres para manipular las estructuras moleculares en Autodesk Maya. La suite de código abierto de contenidos 3D, Blender, contiene varios generados por los usuarios importadores AP. El proceso de hacer una animación en 3D por lo general consta de tres pasos: Modelado: Utilizamos software de gráficos de representación para exportar las superficies a formatos que se pueden importar a Maya. Estas superficies son segmentaciones de tomografías reconstruido, por ejemplo, las membranas, gránulos o filamentos, o representaciones de superficies moleculares. Segmentaciones tomografía se realizan en Amira, superficies moleculares se generan en Chimera o VMD. Representaciones atómica de las moléculas pueden ser importados directamente a Maya a partir de archivos PDB. Una vez que los modelos se encuentran dentro de Maya, que puede ser modificado, duplicado, y se coloca en su caso. Animación: animaciones son de construcción tradicional a mano, con el artista manualmente la reubicación de los objetos en movimiento y la grabación de una serie de fotogramas clave. Los nuevos avances en el software de gráficos 3D permiten ahora a la dinámica que se genere de procedimiento, a través de módulos integrados y las API de scripting. Rendering: la dinámica de procedimiento puede proporcionar animaciones convincentes de la dinámica de los procesos biológicos, tales como la estructura de autoensamblaje. Sin embargo, debido a la dificultad de forma realista la simulación de sistemas biológicos, la mayoría de las animaciones en 3D todavía se construyen con las técnicas tradicionales de fotograma clave. Una vez que la dinámica está en orden, anotaciones visuales, texturas y efectos de iluminación se puede añadir. Finalmente, el camino de la cámara que se elija y la animación terminada se vuelve en una película.