Electron Cryotomography van bacteriële cellen

I. Voorbereiding van de bacteriële cel Cultuur Groei van de bacteriële cellen in hun normale media om de gewenste fase in een enkele ml vloeistof cultuur. Als hogere concentratie nodig is, het spinnen en re-suspensie in verse media kunnen worden aangenomen, maar wees ervan bewust dat dit proces soms structurele veranderingen doorvoert in de cellen. Check in het licht microscoop om te controleren of de cultuur is vrij van verontreinigingen en op een geschikt samenloop. Sommige bacteriële cellen kunnen zelfs stick of groeien op de EM roosters. Bij de groeiende cellen op roosters, goud roosters met een carbon laag worden meestal gebruikt om toxiciteit voor de cellen te voorkomen. Zij moeten gloed gekweten is voor de 2 minuten, gesteriliseerd onder een UV-licht gedurende 15 minuten, en die direct in de vloeistof cultuur. Hechtende cellen zal uiteraard vasthouden aan het net, en anderen kunnen gevraagd worden om aan het net houden door het bekleden van het raster in 0,1% poly-L-lysine de eerste plaats. Controleer de roosters in het licht microscoop eerst of de concentratie van de cellen geschikt is voor het invriezen. II. Plunge invriezen dunne cellen Voor dunne bacteriële cellen, de schorsing van intacte cellen is een duik ingevroren in een EM-raster. Het proces behoudt de ultra-structuur van de bacterie cellen en zal het water verdamping te voorkomen in het hoge vacuüm van de EM later. Het kan worden gedaan met op maat gemaakte duik bevriezing apparaten, of zoals we hier laten zien, met een commerciële automatische duik vriezer, FEI Vitrobot MKIII 4. Glimontlading de koolstof gecoate EM rooster voor 2 – 4 minuten. Dit maakt het oppervlak van het rooster hydrofiele, hetgeen zal bijdragen tot het monster gelijkmatig verspreid over het hele net. Mix 100μl colloïdaal goud oplossing (deeltjesdiameter van 10 nm) met 25μl van een 5% geconcentreerd BSA-oplossing. De BSA lagen de gouddeeltjes en dit voorkomt dat ze aggregatie. Centrifugeer de BSA en goud deeltjes mengsel bij 18000g gedurende 15 minuten. Na het verwijderen van het supernatant, wordt het resterende goud pellet gemengd met 20 ui cel oplossing. De BSA behandeld gouddeeltjes niet reageren met de cellen, maar ze zullen nodig zijn als de vaste markers voor reconstructie van het tomograms. Van toepassing zijn 4 ui van de cel en gouden oplossing mengsel aan de gloed ontslagen EM rooster in de Vitrobot bij 100% vochtigheid. Het raster wordt dan automatisch uitgewist van beide zijden met Nr 1 filter papier. Dit verwijdert overtollige vloeistof, zodat slechts een dun laagje cellen in hun media blijft. Het raster is daarna snel ondergedompeld in een vloeibaar mengsel van ethaan en propaan, dat is afgekoeld tot ongeveer 77K met vloeibare stikstof. Tijdens dit proces wordt het monster zo snel ingevroren dat de vorming van ijskristallen wordt voorkomen in dunne films <1 micrometer. Verwijder voorzichtig het rooster van het ethaan / propaan mengsel en zo snel mogelijk in een raster opbergdoos die is gehouden onder vloeibare stikstof. III. High Pressure Invriezen en Cryo Sectioning van dikkere cellen Voor dikkere cellen, hoge druk bevriezing ijs kristallisatie vermindert en de daarop volgende cryo snijden maakt monsters dun genoeg voor EM imaging. 5, 6, 7 Er zijn veel verschillende preparaathouders beschikbaar voor hoge druk bevriezen, zal uw keuze hangt af van de steekproef, het type bevriezing machine gebruikt of de onderzoeksbevoegdheden applicatie geselecteerd. Hier gebruiken we Bal-Tec HPM 010 hoge druk vriezer en cryo ultra microtoom model UC6/FC6 van Leica Microsystems. Voor bacteriën, is 15mls spinner cultuur OD> 0.5 rechtstreeks uit de 37 ° C incubator en gecentrifugeerd bij 1000 tpm gedurende 3 minuten. Na het verwijderen van supernatant, mix 0,5 ml van de resterende cultuur pellet met 0,5 ml van 20% dextran cryoprotectant en centrifugeer bij 13000rpm gedurende 15 seconden. Na het verwijderen van supernatant, pipet 0,1 ml van de super pellet te plakken in warmte-verzegelde micropipet tip die reeds bevat 0,2 ml 20% dextran cryoprotecant (40000Mwt). Centrifugeer het mengsel in de micropipet tip op 13000 rpm gedurende 30 seconden en verwijder de supernatant. 5-10 ui strak pellet wordt gezien op de verzegelde tip. Een "Teflon" bekleed koperen koepel planchet klaar gemonteerd in de hoge druk vriezer houder arm krijgt de pasta in een half-koepel en is verzegeld met zijn platte partner koperen hoed. De arm assemblage wordt dan onmiddellijk opgenomen in het gegrond hoge druk vriezer klaar voor het invriezen. Op 2100 bar druk de gecombineerde koperen planchet eenheid waarin de cellen wordt snel gekoeld door een straal van hoge druk vloeibare stikstof, het verwijderen van de arm montage direct en storten in een bad van vloeibare stikstof voorkomt dat de planchet van de aarde. Planchet-eenheden worden opgeslagen onder vloeibare stikstof totdat die nodig zijn voor cryo-snijden. Bloot te leggen de goed bevroren koepel van cellen voor snijden, zijn de twee koperen planchets zorgvuldig gescheiden under vloeibare stikstof. De perfect bevroren koepel van cellen is glazig, vrij van scheuren en ijs nucleatie scheuren. Dit planchet is overgebracht naar een voorgekoeld -170 ° C kamer en gemonteerd stevig op de cryo-microtoom vice-achtige chuck. Het afgekoelde cryomicrotoom bevat essentiële cryotools nodig is voor het snijden, deze omvatten: een lage hoek cryo-diamant mes, een diamant trimmen hulpmiddel, drukt u op platform, grid storage box, een anti-statische spray unit en een raster holding apparaat. Voor een succesvolle lint snijden een buitenste koepel regio is in eerste instantie gevormd om <0,2 mm vierkant door de diamantindustrie trimmen tool en een snelle snijden snelheid met behoud van de ~ 200μm diepte van goed bevroren perimeter. Met de antistatische spray gericht op de lage hoek mes en koper ondersteunen roosters in de nabijheid, de diamant mes is zorgvuldig gevorderd tot het gepolijste blok gezicht klaargemaakt voor het snijden. Microtoom parameters worden gekozen, zoals een sectie dikte-instelling tussen de 50 tot 350 nm, samen met een snijsnelheid van ~ 0.4mm/sec en smalle snijden venster. Het is belangrijk om de controle van de antistatische spray bereik en de intensiteit te lage luchtvochtigheid omstandigheden in de directe omgeving. Als de eerste hoofdstukken worden geproduceerd een fijne wimpers applicator wordt gemanoeuvreerd met de hand of micromanipulator aan het begin van de secties schuiven uit de lage hoek diamant mes addertje onder het gras. Terwijl het lint van secties is forced off the mes, worden ze voorzichtig ondersteund door een wimper sonde en geleid over het koperen netwerk te ondersteunen in de buurt. Te houden de secties, het raster geladen met linten is vervolgens stevig geperst met behulp van een gekoeld gepolijst zilver probe, zijn sommige secties zo sterk geladen de nieuwste anti-statische apparaten kunnen helpen bij de hechting proces. Grid dozen worden bewaard voor de lange termijn opslag in een vloeibare stikstof gekoelde droge verlader tot de microscoop klaar is voor grid overdracht. IV. Onderzoek de cellen met behulp van de Cryo lichtmicroscoop De bacteriële cellen op de grid kunnen worden afgebeeld met behulp van de cryo lichtmicroscoop (cryoLM). De microscoop die we gebruiken hier een aangepaste Nikon omkeermicroscoop Ti E / B met extra lange werkafstand (ELWD) 60x lucht objectief. De roosters worden bewaard in een cryo fase van beeldvorming, die is een gemodificeerde FEI cryo podium voor lichtmicroscoop. Met behulp van een vinder raster, kunnen de cellen worden gevestigd op de grid pleinen en de cryoLM beelden worden gecorreleerd aan de cryoEM tomograms. Belasting om te zetten in patronen op cryo-station. De cartridges zijn op maat gewijzigd ten opzichte van onze standaard EM cartridge voor de FEI-TF30H polara. Het raster wordt vastgehouden door koperen clip ringen. De cartridge wordt dan bewaard in een buis in vloeibare stikstof voor de overdracht. Koel de Cryo podium tot temperatuur van vloeibare stikstof (-190 ° C). Laad de cartridge in de cryo podium en zet het rooster in het venster. Het podium biedt plaats aan maximaal twee aangepaste aangepast cartridges. Laat de condensor lens en de focus van de 60x objectief op grid. Zoek de cellen en foto's maken. Voor gecorreleerd LM en EM onderzoek is het net gescand in de omgeving van de cellen, voor het lokaliseren van de cellen later in EM. Na de beeldvorming van de grid, weer de cartridge in de buis en houd de buis in vloeibare stikstof tot klaar om te worden afgebeeld in EM. V. Verzamel Tilt Series in de Cryo TEM Voor het verkrijgen van een 3D-tomogram van de bacteriële cel, zijn een reeks van projectie foto's genomen, terwijl het monster wordt stapsgewijs gekanteld langs een of twee assen in de cryo TEM. Gezien de kantelhoeken en andere experimentele instellingen, zijn er verschillende software die beschikbaar is voor het automatisch verzamelen van de tilt-serie. Wij gebruiken Leginon voor onze cryo TEM die FEI TF30H-polara. Het maakt voor het automatisch nemen tilt serie van vooraf geselecteerde cellen. 8 Laad de cartridges in de multi-selectie houder (MSH) op het voorgekoeld cryo station. De MSH kan maximaal 6 patronen. Sluit de MSH aan de TF30H-polara, kies een cartridge en plaats deze in de EM kolom. Start Leginon-client op de computer en EM Leginon de belangrijkste programma op het andere werkstation. Stel presets (image voorwaarden) voor een Leginon sessie. De belangrijke parameters zijn de vergroting, de onder concentreren waarde, het elektron dosis en de tilt hoeken voor tilt-serie, waaronder het starten hoek, eind hoek en stappen. Kies doelen op beelden vanaf de kleinste vergroting en stuur ze naar de volgende stap met een hogere vergroting. In de rij staan ​​alle doelen voor de tilt-series collectie en legt ze allemaal naar de finale "tomografie" stap. Het proces van het verzamelen van gegevens kan worden gecontroleerd via de web-tool van een lokaal werkstation. Na de experimentele het verzamelen van gegevens wordt gedaan, naar benedenbelasting van de ingevulde tilt-serie op een lokaal werkstation voor de wederopbouw. VI. Bioveiligheid overwegingen Het merendeel van de biologische monsters waar we mee werken zijn niet-pathogene en zijn geïsoleerd van de bodem, leidingwater of de darm van insecten. Basic aseptische techniek is voldoende voor de behandeling van deze monsters. Het werken met pathogenen vereist de uitvoering van de extra veiligheid stappen, echter voor extreme gevaren, een aantal laboratoria hebben hele cryo-EM microscopen binnen BSL-3 labo's geïnstalleerd. De volgende zijn enkele van de manieren waarop we hebben verminderde het risico van het werken met pathogenen in ons lab. De pathogeniteit van een monster kan worden afgezwakt ofwel chemisch of genetisch. Veel laboratoria doen cryo-EM van virussen geïnactiveerd hebben ze met chemische fixatieven voorafgaand aan de duik-invriezen. Als alternatief kan de belangrijkste mutaties worden geïntroduceerd, dat maken de monsters niet-infectieuze, waaronder bijvoorbeeld inactiveren van puntmutaties in bepaalde enzymen of het uitspelen van receptoren. Persoonlijke beschermingsmiddelen, zoals handschoenen, labjas en veiligheidsbril te worden gedragen. Gevaarlijke monsters kunnen worden behandeld in een bioveiligheid kast (BSC). Bacteriële culturen kan worden gekweekt, geconcentreerd, en zelfs de duik-bevroren op EM roosters in de BSC. We hebben een kleinere, handmatige duik-invriezen apparaat dat in onze BSC past voor dit doel. Als het een grotere samenhang worden aangeboden door automatische duik-vriezers nodig is, kan ze ofwel worden geïntroduceerd in de BSC, of, eenvoudiger, in sommige gevallen hebben we gesteund blotting de pads van onze Vitrobot met aluminium folie om vervuiling van het apparaat te voorkomen. Bij het werken met een BSC, zoals veel van de gereedschappen en materialen als mogelijk in te gaan op of uit de kast moet worden gedesinfecteerd met 70% ethanol. Bij de voorbereiding van onze roosters maken we gebruik van kleine hoeveelheden van een bacteriële of virale cultuur (meestal 4 ul), waarvan de meeste wordt uitgewist door de Whatman papier. Het vloeipapier, pipetpunten, en de resterende cultuur zijn afgevoerd als biologisch gevaarlijk afval. Alle gereedschappen en blootgestelde oppervlakken worden gedesinfecteerd met verdund bleekwater, 95% ethanol en vervolgens met water. Zodra de roosters zijn ingevroren, worden ze bewaard in vloeibare stikstof temperaturen gedurende opslag en het verzamelen van gegevens. Het is aangetoond dat cellen kunnen overleven invriezen en dan ontdooien, al, dus we blijven om hen te behandelen als gevaarlijk door de opslag en het verzamelen van gegevens. Aan het einde van het verzamelen van gegevens, worden patronen met bevroren roosters verwijderd van de cryo-TEM en viel direct in 70% alcohol. Hoewel zeldzaam, dient te worden opgemerkt dat soms grids zijn "vallen" in de kolom, en de gevolgen van een dergelijk evenement moet worden overwogen voor elke gevaarlijke monster. Het grootste deel van de microscoop is bij kamertemperatuur, zodat het monster op een rooster laten vallen zou waarschijnlijk dooi in de kolom en worden volledig uitgedroogde in de ultra-hoog vacuüm van de EM. Dit zou natuurlijk te inactiveren sommige biologische monsters, maar misschien niet robuust virussen, en het verdroogde overblijfselen van het monster zou kunnen worden vrijgegeven als spuitbussen bij de microscoop kolom naast wordt geopend voor service. VII. Tomogram Wederopbouw De tomograms van de bacteriële cellen worden gereconstrueerd door middel van software. Er zijn verschillende software beschikbaar voor deze job. We maken gebruik van Raptor voor automatische wederopbouw en screening tomograms. 9 Zoals automatische tilt-serie uitlijning en de daaropvolgende reconstructie is een niet-triviale taak, Raptor op dit moment niet beschikt over een 100% slagingspercentage. In het geval van Raptor storing of de behoefte aan een hoogwaardige reconstructie maken wij gebruik van manuele beelduitlijning en reconstructie met eTomo in de IMOD tomografie software suite. 10, 11 Download elke individuele tilt-serie van de plaatselijke Leginon webserver. Sla ze op in een map waar ze gemakkelijk kunnen worden gelokaliseerd. Handmatig controleren van de tilt-serie met behulp van IMOD's 3dmod viewer en gooi die als Leginon is mislukt volgen van het doel of het produceren van een handige tilt-serie. We lopen Raptor verdeeld over de Linux-machines in het lab door middel van Peach (een Pearl-gebaseerd systeem om taken te verdelen via een netwerk). We geven aan de omvang van ons de vaste markers, dat wil zeggen de colloïdale gouddeeltjes, het aantal markers te gebruiken voor de wederopbouw, de pixel-formaat, de gewenste dikte van de wederopbouw, de binning factor en een aantal basis instellingen (zoals input, uitgang paden en output formaat) op de command line en laat het te lopen, over het algemeen tot 2u 20min voor een 122-image-dataset (2k door 2k). Als tevreden bent met de reconstructie resultaat, kan de onderstaande stappen in deze sectie worden overgeslagen. Wanneer de handmatige reconstructie nodig is, hernoemen van bestanden van ". MRC" naar ". St" en load individuele kantel-serie in de eTomo GUI in de IMOD tomografie suite. Geef de tilt-serie as type (enkele of dubbele assen) en voer de vaste grootte van die in sample voorbereiding. Scannen van het bestand header om pixelgrootte te bepalen en door te klikken op "Create Com scripts" te gaan. Volg de stappen van elk tabblad in het eTomo GUI om de tomogram reconstrueren van de tilt-serie. Inspecteer en controleer het resultaat na elke stap, en indien niet tevreden, kunnen we altijd terug naar een vorige stap en opnieuw verwerken van daar. "Pre-processing" is om voorbereidende verwerking uit te voeren en te verwijderen abnormaal hoge intensiteit pixels veroorzaakt door X-stralen. "Grof alignment" produceert een tilt-serie waarin elk volgend projectie afbeelding in het tilt-serie is afgestemd op de vorige door de cross-correlatie. We definiëren die gouden kralen om te gebruiken als fiducials in "vaste Model Generation", en het programma volgt de de vaste markers in elke projectie beeld en bouwt "Fine Alignment". "Tomogram positionering" kan bijgesneden, de tomogram in Z. "Final Aligned Stack" is gegenereerd met behulp van lineaire interpolatie, en functies zoals CTF-correctie, Gold-Eraser en 2D-filtering kan optioneel worden toegepast. De tomogram wordt berekend in "Generate tomogram" door het gewogen back-projectie in Fourier ruimte. "Post-processing" kunt bijsnijden van de tomogram naar de XY-gebied van belang en de schaalvergroting van het contrast in het bereik van de structuren van belang, en "Clean Up" verwijdert de tijdelijke bestanden en bevrijdt de schijfruimte. VIII. Opslag van de Tomograms in Database We maken gebruik van een web-based in-house database te organiseren, opslaan, zoeken en distribueren van de tomografische gegevens. Voor elke tilt-serie, kunnen we registreren sample details, microscoop verzameling parameters, rauw tilt series alsmede bijbehorende 3D reconstructie en andere behandeling van de dossiers. De belangrijkste browsen pagina met een miniatuurafbeelding en een featured "YouTube", zoals film voor elke tomogram, en de ingangen kunnen worden georganiseerd door downloaden van de frequentie, de schepper, model type of datum. Gebruikers kunnen zoeken in de databank door het invoeren van trefwoorden of speciale functies. Momenteel meer dan 4500 tomografische tilt-serie zijn gedeponeerd in de database, die bijna 60 soorten van soorten / exemplaar, met een totaal van meer dan 11.000 bijbehorende bestanden. IX. Analyse en segmentatie van de Tomograms De structurele details van de tomograms kunnen worden bekeken en geanalyseerd door verschillende software met beeldverwerking gereedschap, bijv. 3dmod kijker van IMOD met ZAP, XYZ en Slicer venster. De volgende stap is het maken van een segmentatie van het 3D-beeld (tomogram). Een segmentatie kent aan elke voxel (volumetrische pixel) van de 3D-beeld een etiket beschrijft aan welke regio of het materiaal van de voxel behoort, bijvoorbeeld een membraan of een cytoskelet. We maken gebruik van software tools zoals 3dmod in IMOD en Amira (Visage Imaging). Hoewel sommige software tools voor automatische segmentatie modules (bijv. drempel segmentatie), zijn ze vaak alleen werken voor afbeeldingen met een hoog contrast. De 3D beelden afkomstig van een lage dosis elektronen cryotomography zo'n laag contrast dat in de meeste gevallen moeten we een label handmatig toe te wijzen aan elke voxel. De segmentatie is opgeslagen in een aparte data-bestand. Het kan worden gebruikt om een ​​oppervlak model waarbij elke regio wordt weergegeven met een andere kleur en bekeken in 3D te genereren. De tomograms kan worden gebruikt voor andere analyse. Zo kan bijvoorbeeld template matching en nacalculatie opbrengst statistische informatie van de macromoleculaire complex, zoals ribosomen. Subvolume uitlijning en gemiddeld shows structuren in een hoger contrast en onthult fijnere details. X. Het maken van films gebaseerd op tomograms We maken films naar elk project samen te vatten en om een ​​visuele rondleiding door onze tomografische beelden te geven. Maak een script van de functies in de gegevens die we willen laten zien en hoe deze functies weer te geven. Bijvoorbeeld, in een typische film van een whole-cell tomografie project, beginnen we door het tonen van een vertegenwoordiger tilt-gegevensreeksen en daarna volgen met een slice-by-slice uitzicht op de gereconstrueerde tomogram. Vervolgens tonen we een segmentatie van de belangrijkste macromoleculen in de cel, bijvoorbeeld, een flagellaire motor of een chemoreceptor complex of een cytosolische filament. Tot slot sluiten we af met een model met een geïdealiseerde interpretatie van de macromoleculen die we bestuderen. Grafische representatie software zoals Amira of Chimera worden gebruikt om de individuele nog frames van de film te maken. We meestal assembleren films van kortere clips om wijzigingen aan elke clip te vergemakkelijken. Gebruik commerciële movie editing software zoals Adobe Premiere aan de nog steeds beelden in de filmpjes, en dan de filmpjes monteren in de uiteindelijke film. We zijn begonnen met een audio-track die de film vertelt toe te voegen. Het verhaal fungeert als een "film legende 'en laat het publiek zich te richten op de gegevens die worden gepresenteerd tijdens het kijken naar de film. XI. Animatie Visualstorytelling communiceert kennis zonder dat de complexe woordenschat van specifieke wetenschappelijke domeinen. Moeilijke begrippen worden eenvoudig indien vergezeld van visuele demonstratie. De praktijk van het illustreren biologische ideeën met cartoons is niet nieuw. Echter, pas in de laatste tien jaar hebben de geavanceerde tools van professionele 3D content creatie zijn uitgeoefend op de taak van de bouw van wetenschappelijke animaties. Er zijn nu tientallen onderzoekers actief vertalen van biologische systemen in dynamische 3D-animaties. Veel mooie animaties zijn tentoongesteld op http://MolecularMovies.org . Die site bevat ook tutorials en distribueert een gratis toolkit voor het manipuleren van moleculaire structuren in Autodesk Maya. De open source 3D content suite, Blender, bevat een aantal user-generated PDB importeurs. Het proces van het maken van een 3D-animatie gaat over het algemeen drie stappen: Modeling: We maken gebruik van grafische representatie software om oppervlakken te exporteren naar formaten die kunnen worden geïmporteerd in Maya. Deze oppervlakken zijn ofwel segmentaties uit gereconstrueerd tomograms, bijvoorbeeld, membranen, korrels, of filamenten, of vertegenwoordigingen van moleculaire oppervlakken. Tomogram segmentaties worden uitgevoerd in Amira, moleculaire oppervlakken worden gegenereerd in de Chimera of VMD. Atomic representaties van moleculen kunnen direct worden geïmporteerd in Maya uit VOB-bestanden. Nadat de modellen zijn binnen de Maya's, kunnen zij worden gewijzigd, verveelvoudigd, en gepositioneerd naargelang het geval. Animeren: Animaties worden traditioneel gebouwd met de hand, met de kunstenaar handmatig verplaatsen van bewegende objecten en het opnemen van een aantal belangrijke frames. Nieuwe ontwikkelingen in de 3D-grafische software nu toe dat de dynamiek te procedureel worden gegenereerd, via de ingebouwde modules en scripting API's. Rendering: Procedurele dynamiek kan overtuigende animaties van dynamische biologische processen, zoals structurele zelf-assemblage. Toch is te wijten aan de moeilijkheid van een realistische simulatie van biologische systemen, zijn de meerderheid van de 3D-animaties nog steeds gebouwd met behulp van traditionele key frame technieken. Zodra de dynamiek in orde zijn, kan visuele aantekeningen, texturen en lichteffecten worden toegevoegd. Ten slotte wordt de camera weg gekozen en de voltooide animatie is gemaakt in een film.