Reinicie directa de un Tenedor replicación en punto muerto por una polimerasa de ARN Head-On

Este método se utilizó en la investigación publicada en Pomerantz y O'Donnell, Ciencia 327, 590 a 592 (2010) . 1. Montaje de un complejo RNAP elongación detenido se llevó a cabo de la siguiente manera: 500 nM concentración final de E. RNAP coli σ 70 SE se mezcló con la concentración de 5 nM final de una plantilla de ADN biotinilado 3,6 kb que contenía el promotor T7A1 en 100 l de tampón A (20 mM Tris-Cl (pH 7,5), 8 mM MgCl 2, 0,5 mM EDTA, 5 mM DTT, 10% de glicerol) por 10 min a 37 ° C. 100 mM de APU y 40 mM de cada uno de GTP, ATP, CTP y se añadieron durante 10 min a 37 ° C. 2. Inmovilización del complejo RNAP elongación detenido en perlas de estreptavidina se realizó de la siguiente manera: 200 l de bolas recubiertas de estreptavidina magnética (Invitrogen) se añadieron a la reacción anterior por 10 min a temperatura ambiente. 3. Purificación del inmovilizado complejo detuvo elongación RNAP se realizó de la siguiente manera: Las perlas (desde arriba) se lavaron 5 veces con 0,9 ml de un buffer que contiene 0,75 M NaCl, 200 mg / ml de heparina, y 20 mg / ml ssDNA (Se retiró el sobrenadante después de cada paso de lavado por separación magnética.) A continuación, el bolas se lavaron dos veces con 0,9 ml de tampón A. 4. Formación de un tenedor de replicación aguas abajo con respecto a la cabeza de RNAP se realizó de la siguiente manera: Las perlas (desde arriba) se resuspendieron en 100 l de New England Biolabs buffer 4 y 10 unidades de Sap I (New England Biolabs) se añadió durante 10 min a 37 ° C. Las bolas se lavaron 3 veces con 0,9 ml de tampón A y se resuspendió en 50 l de tampón T4 rápida reacción de ligación (New England Biolabs). 2 l de ligasa rápida T4 (New England Biolabs) se añadió junto con la concentración nM 6 final de la pre-templado de ADN horquilla (RP10, RP22, RP25) durante 10 minutos a temperatura ambiente. Las bolas se lavaron 3 veces con 0,9 ml de tampón A. 5. Asamblea de la replisoma y la iniciación de la síntesis del filamento principal en el tenedor de replicación se llevó a cabo de la siguiente manera: 448 pmol de DnaB (como hexamer) se incubó con las perlas de 150 l de tampón A (20 mM Tris-glicerol Cl (pH 7,5), 8 mM MgCl 2, 0,5 mM EDTA, 5 mM DTT, 10%) durante 30 s en 23 ° C. 4,9 pmol de Pol III * (Pol III HE menos β), 15 pmol de β, 2 mM de ATP, y 60 M cada uno de dGTP y dATP se han añadido a un volumen de 200 l y se incubaron en un 5 minutos a 37 ° C. La replicación se inició en la adición de 10 mg SSB y 24 mM de cada uno de dATP y dTTP, junto con [α-32P] dTTP y [α-32P] dCTP (actividad específica, 3,000-5,000 cpm / pmol) hasta un volumen final de 250 l. Reacciones se terminaron después de 10 minutos después de añadir 12 l de 500 mM EDTA. 6. Purificación y concentración de la radio-etiquetados de ADN se realizó de la siguiente manera: Las perlas (desde arriba) se hierve después de la reacción se terminó con el fin de eliminar el ADN de las cuentas. Cualquier ADN residual que queda unido a las cuentas fue eliminado por el tratamiento de las cuentas con proteinasa K en un volumen de 10 ul por 30 min a 50 ° C. Las cuentas fueron hervidos y luego se retiró el sobrenadante por separación magnética. El sobrenadante combinado que contiene el ADN fue purificado utilizando el kit Qiagen PCR de limpieza. Purificada de radio-etiquetados de ADN fueron analizadas en un gel de agarosa alcalinas. * Replicación en la ausencia de una cabeza de RNAP detuvo complejo de elongación se realizó el anterior, sin embargo, σ 70 fue omitido. Los resultados representativos: Colisión de la replisoma con una cabeza de RNAP usualmente resulta en dos productos de 2,5 kb y 3,6 kb de longitud. El producto de 2,5 kb representa la longitud del ADN a partir de el tenedor a la RNAP se detuvo y los resultados de replisoma estancamiento en colisión con la RNAP. El producto representa 3,6 kb de longitud completa de ADN y los resultados de cualquiera de ocupación incompleta del promotor por RNAP o parcial replisoma la lectura a través de la RNAP de frente. Un buen resultado o precisa demuestra que aproximadamente el 50% de larga duración en el ADN que se produce. Sin embargo, en algunos casos menos de ocupación del promotor por RNAP se produce y un mayor porcentaje de larga duración en el ADN se observa desde una población mayor de replisomes no encuentro un RNAP de frente. Replicación en la ausencia de un resultado RNAP se detuvo en un solo cuerpo entero de ADN (3,6 kb). Figura. 1 El replisoma se ve impedida por un RNAP de frente. (A) de un montaje experimental. A E. columnai RNAP complejo de elongación detenido fue montado en un ADN biotinilado que contiene el promotor T7A1 como se describió previamente (9). En pocas palabras, un complejo de elongación detenido se formó 20 bps abajo del promotor mediante la incubación de holoenzima RNAP con el ADN biotinilado durante 10 minutos seguido por la adición de Apu, GTP, ATP, CTP y por un período de 10 min. Cuentas de estreptavidina se añadieron durante 10 minutos después, las perlas se lavaron cinco veces cada uno con 0,9 ml de solución tampón que contiene 0,75 M NaCl, 200 mg de heparina / ml, y 100 nm de una sola hebra de ADN para eliminar inestable ADN RNAP complejos y el exceso de PNT . El ADN fue digerido con Sapi, se lavan, y se liga a una horquilla de ADN antes de recocido. Las bolas se lavaron una vez más antes de la asamblea de los replisoma. El promotor se encuentra a 2,5 kb del tenedor y se orienta a la transcripción directa hacia el tenedor. (B) DnaB se añade entonces la replisoma fue ensamblado y replicación se inició ya sea en presencia (carril 2) o ausencia (carril 1) de un de frente RNAP.