Head-On RNA Polimeraz Stalled Çoğaltma Fork Doğrudan yeniden başlatın

Bu yöntem bildirilen araştırmada kullanılan Pomerantz ve O'Donnell, Science 327, 590-592 (2010) . 1. Durdurulmuş RNAP uzama kompleksi Meclisi şu şekilde yapıldı: E. 500 nM nihai konsantrasyonu coli RNAP HE 100 A (20 mM Tris-Cl (pH 7.5), 8 mM MgCl 2, 0.5 mM EDTA, 5 tampon ul T7A1 organizatörü içeren bir biotinlenmiş 3.6 kb DNA örneğinin 5 nM nihai konsantrasyonu ile karışık 70 σ 10 dk 37 mM DTT,% 10 gliserol) ° C. APU ve her biri 40 mcM, GTP, ATP ve CTP 100 mcM 37 ek bir 10 dakika ° C eklendi 2. Streptavidin boncuk üzerine durduruldu RNAP uzama kompleksi immobilizasyonu şu şekilde yapıldı: 200 ul streptavidin kaplı manyetik boncuk (Invitrogen) Yukarıdaki reaksiyon oda sıcaklığında 10 dakika ilave edildi. 3. Immobilize durduruldu RNAP uzama kompleksi Arıtma şu şekilde yapıldı: Boncuk tampon 0.9 ml A içeren 0.75 M NaCl, 200 mg / ml heparin ve 20 mg / ml Sonraki ssDNA (süpernatant manyetik ayırma her yıkama adımdan sonra kaldırıldı.), (Yukarıda) ile 5 kez yıkandı boncuk, 2 kez 0.9 ml tampon A. ile yıkandı 4. Baş-on RNAP şu şekilde yapılmıştır downstream göreceli bir replikasyon çatal Oluşumu ° C, boncuk (yukarıda) New England Biolabs tampon 4 ve Sap (New England Biolabs) 10 adet 100 ul yeniden süspanse 37 10 dakika eklendi. Boncuk 0.9 ml tampon A ile 3 kez yıkanır ve ardından Hızlı T4 ligasyon reaksiyon tamponu (New England Biolabs) 50 ul yeniden süspanse edildi. Hızlı T4 ligaz (New England Biolabs) 2 ul oda sıcaklığında 10 dakika için ön tav-çatallı DNA 6 nM final konsantrasyonu (RP10, RP22, RP25) ile birlikte eklendi. Boncuk 0.9 ml tampon A. ile 3 kez yıkandı 5. Çoğaltma çatal önde gelen iplikçik sentez replisome ve inisiyasyon Kurul şu şekilde yapıldı: Tampon boncuk 150 ul 448 pmol DnaB (hexamer gibi) ile inkübe edildi (20 mM Tris-Cl (pH 7.5), 8 mM MgCl 2, 0.5 mM EDTA, 5 mM DTT,% 10 gliserol) az 30 s 23 ° C Pol III 4.9 pmol * (Pol III HE eksi β), 15 pmol β, 2 mM ATP ve her biri 60 mcM dGTP ve dATP hacmi 200 ul eklenir ve 37 az bir 5 dakika daha ° C inkübe edildi Çoğaltma ile birlikte 10 mg SSB ve her biri 24 mcM dATP ve dTTP ekleyerek üzerine başlatılan [α-32 P] dTTP ve [α-32 P] dCTP (spesifik aktivite, 3.000-5.000 cpm / pmol) son hacmi 250 mcL. Reaksiyonları 12 ul 500 mM EDTA ekleyerek üzerine 10 dakika sonra sona erdirildi. 6. Arıtma ve radyo-işaretli DNA ürünlerin konsantrasyonu şu şekilde yapıldı: Reaksiyon boncuk DNA kaldırmak için sona erdirildi sonra boncuk (yukarıda) kaynatılır. 50 – 30 dk 10 ul hacmi proteinaz K ile boncuk tedavi ° C boncuklar bağlı kalan herhangi bir kalıntı DNA tarafından kaldırıldı Boncuk sonra kaynatılmış ve manyetik ayırma süpernatantı tarafından kaldırıldı. DNA içeren kombine süpernatant Qiagen PCR Temizleme kiti kullanarak saflaştırılmış. Saf radyo-işaretli DNA ürünleri daha sonra alkali agaroz jel analiz edildi. * Baş RNAP uzama kompleksi yukarıdaki gibi yapıldı durdurdu, ancak σ 70 yokluğunda Çoğaltma atlandı. Temsilcisi Sonuçlar: Çarpışma ile replisome bir baş-RNAP genellikle 2,5 kb ve uzunluğu 3,6 kb iki ürün ile sonuçlanır. 2,5 kb ürün durduruldu RNAP ve RNAP ile çarpışması üzerine durdurduklarını replisome sonuçları çatal DNA uzunluğu temsil eder. 3.6 kb ürün eksik RNAP organizatörü doluluk veya kısmi replisome baş RNAP salt yoluyla tam uzunlukta DNA ve sonuçları temsil eder. Iyi ya da doğru bir sonucu, yaklaşık% 50 tam uzunlukta DNA olduğunu göstermektedir. Ancak, bazı durumlarda RNAP organizatörü az doluluk oluşur ve daha yüksek bir yüzdesi tam uzunlukta DNA replisomes daha büyük bir nüfus beri gözlemlenen bir baş-RNAP karşılaşma yok. Sadece tam uzunlukta DNA (3.6 kb) durduruldu RNAP sonuçları yokluğunda Çoğaltma. Şekil. 1 replisome baş RNAP engellemektedir. (A) Deneysel kurulum. A E. coli RNAP durduruldu uzama kompleks, daha önce açıklandığı gibi T7A1 organizatörü (9) içeren bir biotinlenmiş DNA üzerine monte edildi . Kısaca, durdurulmuş bir uzama kompleksi APU, GTP, ATP ve CTP bir 10 dakika daha ilave edilerek 10 dakika için biotinlenmiş DNA ile RNAP holoenzyme kuluçka organizatörü 20 bps downstream kuruldu. Streptavidin boncuk boncuk 0.75 m NaCl, 200 mg / ml heparin içeren ve 100 nM tek iplikli DNA kararsız RNAP-DNA kompleksleri ve aşırı UTP'larının kaldırmak için 0.9 ml tampon beş kez yıkandı ek bir 10 dakika ilave edildi . DNA sonra Sapi ile sindirilmiş, yıkanmış ve bir ön tav-çatallı DNA bağlandı oldu. Boncuk replisome montaj öncesinde tekrar yıkandı. (B) DnaB sonra replisome toplandı eklendi ve çoğaltma ya varlığında başlatılan (şeritli 2) veya yokluğu (şeritli 1) organizatörü çatal 2,5 kb bulunan ve çatal yönelik doğrudan transkripsiyon yönelik. baş üzerinde RNAP.