유전자 발현 연구를 단순화하는 자동 셀 카운터를 사용하여 : Namalwa 셀에서 IL - 4 종속 유전자 발현의 siRNA의 최저

1. Namalwa 세포를 준비하여 계산 문화 플라스크에서 세포를 제거하고 펠릿에 세포를 원심 분리기. PBS의 유명한 볼륨에 뜨는 및 resuspend 세포를 제거합니다. 이 프로토콜에 사용되는 세포 현탁액 세포입니다. 당신은 자기편 세포를 사용하는 경우가 수집되기 전에 trypsinize해야합니다. 라이브 세포의 수를 확인하려면 계산 슬라이드에 0.4 % trypan 파랑 솔루션과 혼합물의 pipet 10 μl로 1시 1분를 혼합하여 세포 현탁액의 나누어지는을 얼룩 다음 TC10 자동 세포에 슬라이드를 삽입 카운터 (바이오 래드 연구소, 병원). TC10 셀 카운터는 것입 자동 초점 카운팅을 진행 후 가장 정확한 카운트를 보장하고 있습니다. 그것은 자동으로 샘플에 살고있는 세포와 세포 전체의 밀도를 결정합니다. viewscreen에 세포를 표시하는 이미지를 보려면 선택합니다. 다음 TC10 셀 카운터를 가지고 희석 계산기를 선택 자동으로 필요한 것입니다 세포 혼합물의 양을 계산합니다. 이 실험은 세 siRNAs 총을 사용하고 있습니다 : 한 컨트롤 siRNA와 STAT6 유전자, 플러스 untransfected 컨트롤을 대상으로 두 개의 서로 다른 siRNAs합니다. 이것은 ML 당 5 X 10 6 세포의 최종 농도에서 3.6 ML이 필요합니다. 희석 계산기로 원하는 농도와 최종 볼륨 값을 입력하고 그것 샘플에 대한 라이브 셀 개수를 기반으로 세포 현탁액 필요의 볼륨을 계산합니다. 또는 수동으로 계산을 수행합니다. 그런 다음 새로운 튜브로이 실험에 대한 세포 혼합물의 필요한 볼륨을 전송합니다. 펠렛 세포에 세포 섞어 돌려 모든 PBS를 제거합니다. 진 Pulser의 electroporation 버퍼 (바이오 래드 연구소)의 3.6 ML에 Resuspend. 해당 siRNAs를 포함하는 튜브에 800 μl aliquots를 전송하고 부드럽게 섞는다. 세포는 이제 electroporation을 위해 준비가되어 있습니다. 2. 96 – 웰 플레이트에있는 세포를 Electroporating 96 – 웰 플레이트 electroporation은 함께 electroporated하는 네 가지 치료를위한 복제를 허용합니다. 96 – 웰 electroporation 판의 해당 우물에 세포 현탁액 150 μl을 전송합니다. MXcell의 electroporation 플레이트 챔버에 접시를 넣고 뚜껑을 닫습니다. 사용중인 셀 라인과 버퍼에 최적화된 설정을 사용하여 Electroporate. 이러한 세포는 지수 붕괴 250 V의 악기 설정으로 파, 350 μF, 1000 Ω 저항을 사용 electroporated 있습니다. electroporation가 완료되면, 믹스 그리고 미리 예열 미디어를 포함하는 조직 문화 플레이트로 세포를 전송하는 각 우물에 부드럽게 위아래로 피펫합니다. Namalwa 세포는 7.5 % FCS, 1 %의 pyruvate로 보충 RPMI (생명 기술)에 재배하고 있습니다. electroporated되지 않은 컨트롤 샘플은 남아있는 세포 현탁액에서 가져온 및 electroporated 세포에 동일하게 미리 예열 문화 매체 문화 요리에 추가됩니다. 37 밤새 품어 세포 ° C와 5 % CO 2. 24 시간 후, 세포의 한 세트 10 NG / ML 최종 농도 재조합 IL – 4 (R & D 시스템)로 유도했습니다. 제어 세포의 두 번째 세트는 추가적인 미디어를받을 수 있습니다. 모든 세포는 37 ° C와 5% CO 2에서 추가로 24 시간을 incubated 있습니다. 3. RNA를 추출하고 확인 성장의 48 시간 총 후, 각 우물에 세포를 계산하고, RNA 추출을위한 microfuge 튜브 각 잘 한 나누어지는를 전송하고, 모래 바닥 서부 또는 기타 단백질 분석을위한 두 번째 나누어지는을 동결. 펠렛 세포 샘플을 원심 분리기, 다음 각 튜브의 표면에 뜨는를 제거하고 폐기. RNA 추출 진행합니다. 우리는 일반적으로 포함되어있는 프로토콜에 따라 오럼 총 RNA 키트 (생물 래드)를 사용합니다. 타락한 RNA가 오해의 소지가있는 결과를 제공하기 때문에 siRNA 중재 유전자 최저를 모니터링하면 그것은 RNA의 품질을 확인하기 위해 특히 중요합니다. 280분의 260 비율은 RNA의 무결성을 나타내는 것은 아닙니다 그러므로 그것은 RNA가 저하되지 않습니다 확인 젤 또는 microfluidic 장치의 샘플을 실행하는 것이 중요합니다. 한 단계에서 품질과 수량 모두를 평가하려면 다음 샘플은 Experion 자동 전기 영동 시스템 (생물 래드)를 사용하여 분석합니다. 첫째, 열 샘플. 그런 다음, 프라임, 부하, 그리고 소용돌이 Experion RNA 칩. Experion 전기 영동 역에 칩을 삽입하고 실행을 시작합니다. 실행이 완료되면, Experion 소프트웨어 (전통적인 RNA와 유사한 어떤 electropherogram, 결과 테이블의 양식 (RNA 농도, ribosomal 비율, 그리고 RNA 품질 표시 번호를 표시), 그리고 가상 젤 자동으로 결과를 표시합니다 겔). 고품질의 총 RNA 샘플은 일반적으로 80-10의 RQI을 것입니다. </리> 4. 실시간 PCR RNA 품질을 확인 후, cDNA 반응과 함께 진행합니다. 이 실험을 한 반응으로 cDNA 합성과 실시간 PCR을 결합 iScript 한 단계 RT – PCR 혼합 (바이오 래드) 사용됩니다. 각 프라이머 세트에 대한 RNA 템플릿 이외의 모든 반응 구성 요소를 포함하는 마스터 믹스를 확인하고, PCR 플레이트로 그들을 배포합니다. 균일한 농도로 RNA를 diluting 후, 적절한 우물에 RNA 샘플을 추가합니다. 각 반응은 세중의에 설정되어 있습니다. 접시를 밀봉하고, CFX384 실시간 PCR 시스템 (바이오 래드)에 넣습니다. 적절한 프로토콜을 선택하고 실행을 시작합니다. 실행이 완료되면 유전자 발현이 제어 siRNA와 electroporated 세포의 동일한 정상화하는 실험 siRNA와 electroporated 세포에서 참조 유전자에 정규 관심 유전자의 유전자 표현을 비교에 의해 결정됩니다. 5. siRNA의 최저 분석 CCL17의 표현은 CCL17의 IL – 4에 의존 유도의​​ transcriptional 활성제 STAT6의 역할을 조사하기 위해 정량 실시간 PCR을 사용하여 모니터링할되었습니다. 본 실험에서는, GAPDH는 참조 유전자로 사용되었다. 대체 기준 유전자 또는 여러 참조 유전자가 같은 방식으로 사용할 수 있습니다. CFX 관리자 소프트웨어가 자동으로 같은 예제에서 참조 유전자의 표현에 CCL17 표현을 표준 자동으로 단순히 "참조"와 제어 처리 (IL – 4 유도하지 않고 제어 siRNA)로 GAPDH를 선택하여 치료를 제어하는​​ 결과 표준 값을 비교 CFX 관리자 소프트웨어의 실험 설정 창에서 "조정". 없이 IL – 4 유도, CCL17의 전사가 낮은, 제정 수준에서 제어 트리 트먼트 비교 남아. IL – 4로 유도된과 정상 STAT6 경로를 (즉, 제어 siRNA 또는 untransfected 제어 트리 트먼트) 유지 세포는 CCL17 표현의 80-10 배 유도을 보여주었다. IL – 4가 아니라 STAT6 표현 중 STAT6 siRNA의 도입에 의해 저해로 유도된 세포는 CCL17의 IL – 4 유도된 표현 STAT6의 역할을 확인 uninduced 세포보다는 약 2 배 높은 CCL17 표현을 보여주었다. 6. 대표 결과 그림 1. IL – 4 신호 경로의 개요. 의 수용체에 IL – 4의 A) 바인딩은 STAT6의 dimerization 및 활성화로 연결됩니다. 핵에 STAT6 translocates을 활성화 및 CC17로서 목표 유전자의 전사를 활성화한다. B) IL – 4 유도없이 CCL17의 전사가 낮은, 제정 수준에서 유지됩니다. C) STAT6 유전자의 siRNA – 중재의 입을 후, I​​L4 치료는 CCL17 표현에 거의 또는 전혀 증가로 이어질 것입니다. 그림 2. IL4에 의해 CCL17의 유도는 양적 실시간 PCR에 의해 여러 조건으로 측정. A) IL – 4 않고 재배 샘플에 관계없이 유전자 발현의 표현의 낮은 수준을 제정했다. B) 녹색과 파란색으로 그림과 같이, 컨트롤 샘플 IL – 4와 치료에 일반적으로 대응, CCL17의 80-10 배 유도와 함께. 그러나, 세포, 빨간색 및 분홍색에 나타난 STAT6를 타겟팅 siRNAs와 transfected는 아이디어를 지원, IL – 4에 대응 CCL17 표현을 저하 있다고 STAT6 재생 CCL17의 IL – 4 유도된 표현의 역할.