1. Het voorbereiden en het tellen van de cellen Namalwa Verwijder de cellen van cultuur kolf en centrifuge de cellen pellet. Verwijder supernatant en resuspendeer cellen in een bekend volume van de PBS. De cellen die worden gebruikt in dit protocol zijn suspensie-cellen. Als u gebruik maakt van hechtende cellen je nodig hebt om trypsinize voor het verzamelen. Voor het bepalen van het aantal levende cellen, vlek een aliquot van de celsuspensie door het te mengen 1:1 met een 0,4% trypan blauwe oplossing en pipet 10 pi van het mengsel op een glijbaan te tellen, en plaats de dia in de TC 10 automatisch cel teller (Bio-Rad Laboratories, Inc). De TC 10 celgetalmeter zal autofocus om de meest nauwkeurige telling te verzekeren, en ga verder met het tellen. Het bepaalt automatisch de dichtheid van levende cellen en totale cellen in het monster. Selecteer de afbeelding om te bekijken van de cellen op het viewscreen display. Selecteer vervolgens de verdunning rekenmachine om de TC 10 celgetalmeter hebben automatisch berekent het bedrag van cel mengsel dat nodig zal zijn. Dit experiment is met behulp van een totaal van drie siRNA's: een controle siRNA en twee verschillende siRNA's gericht op de STAT6 gen, plus ongetransfecteerde controles. Dit vereist 3,6 ml bij een uiteindelijke concentratie van 5 X 10 6 cellen per ml. Voer de gewenste concentratie en laatste deel waarden in de verdunning rekenmachine, en het berekent het volume van de celsuspensie die nodig zijn op basis van de levende cellen tellen voor dat monster. U kunt ook handmatig de berekening. Vervolgens overbrengen van het vereiste volume van de cel mengsel voor deze experimenten in een nieuwe buis. Spin de cel mengsels pellet de cellen en verwijder alle PBS. Resuspendeer in 3,6 ml van Gene Puiser elektroporatie buffer (Bio-Rad Laboratories). Transfer 800 ul monsters in buizen met daarin de juiste siRNA's en meng voorzichtig. De cellen zijn nu klaar voor elektroporatie. 2. Electroporating de cellen in 96-well platen De 96-well plaat elektroporatie kan de duplo's voor alle vier de behandelingen om samen te zijn geëlektroporeerd. Overdracht 150 pi van de celsuspensie in de juiste wells van een 96-wells plaat elektroporatie. Plaats de plaat in de MXcell elektroporatie plaat kamer en sluit het deksel. Electroporate met de instellingen geoptimaliseerd voor de cellijn en de buffer wordt gebruikt. Deze cellen zijn geëlektroporeerd met behulp van een exponentiële verval golf met een instrument instellingen van 250 V, 350 uF, en 1000 Ω weerstand. Na de elektroporatie is voltooid, pipet op en neer voorzichtig in elk putje om vervolgens mengen en cellen over te dragen aan een weefselkweek plaat met voorverwarmde media. Namalwa cellen worden gekweekt in RPMI (Life Technologies), aangevuld met 7,5% FCS en 1% pyruvaat. Controlemonsters die niet zijn geëlektroporeerd worden genomen van de resterende celsuspensie en toegevoegd aan de cultuur gerechten van voorverwarmde kweekmedium identiek aan de geëlectroporeerd cellen. Incubeer cellen een nacht bij 37 ° C met 5% CO 2. Na 24 uur werd een verzameling cellen geïnduceerd met 10 ng / ml uiteindelijke concentratie recombinant IL-4 (R & D Systems). De tweede set van controle cellen alleen aanvullende media. Alle cellen worden geïncubeerd een extra 24 uur bij 37 ° C en 5% CO 2. 3. Extract en controleer RNA Na een totaal van 48 uur van de groei, de telling van de cellen in elk putje, en de overdracht een aliquot van elk putje naar een microfugebuis voor RNA-extractie en het bevriezen van een tweede volume voor de western blotting of andere eiwit analyse. Centrifuge monsters naar pellet de cellen, en vervolgens te verwijderen en het supernatant gooi van elk buisje. Ga verder met de RNA-extractie. Wij gebruiken meestal de Aurum totaal RNA kit (Bio-Rad) volgens de meegeleverde protocol. Bij het bewaken van siRNA gemedieerde gen knock-down is het vooral belangrijk om te controleren of RNA-kwaliteit, omdat gedegradeerd RNA geeft misleidende resultaten. De 260/280 verhouding geeft niet aan RNA integriteit daarom is het belangrijk om de monsters lopen op een gel of microfluïdische apparaat om te controleren RNA worden niet afgebroken. Voor de beoordeling van zowel de kwaliteit en kwantiteit in een stap, zullen deze monsters worden geanalyseerd met behulp van de Experion automatische elektroforese-systeem (Bio-Rad). De eerste, warmte monsters. Vervolgens, prime, laden en vortex de Experion RNA-chip. Plaats de chip in de Experion elektroforese station en begin met lopen. Na de run is voltooid, wordt de software automatisch Experion resultaten weergeven in de vorm van een electropherogram, resultaten tafel (dat wordt weergegeven RNA-concentratie, ribosomale ratio, en de RNA-kwaliteit indicator nummer), en virtuele gel (die lijkt op een traditionele RNA gel). Hoge kwaliteit totaal RNA monsters hebben typisch een RQI van 8-10. </li> 4. Real-time PCR Na verificatie van de RNA-kwaliteit, verder met de cDNA reacties. Dit experiment gebruikte de iScript een-stap RT-PCR-mix (Bio-Rad) om cDNA synthese en real-time PCR combineren in een reactie. Maak een meester mix met alle reacties op andere onderdelen dan de RNA-sjablonen voor elke primer in te stellen en te verspreiden die in de PCR-plaat. Na verdunning van het RNA om een uniforme concentratie, voeg de RNA monsters naar de juiste bronnen. Elke reactie wordt opgezet in drievoud. Seal de plaat, en plaats deze in de CFX384 real-time PCR-systeem (Bio-Rad). Selecteer het juiste protocol en beginnen met het lopen. Zodra de run is voltooid, wordt genexpressie bepaald door het vergelijken van gen-expressie van het gen van belang genormaliseerd naar een referentie-gen in cellen geëlektroporeerd met experimentele siRNA om dezelfde normalisering van de cellen geëlektroporeerd met een controle siRNA. 5. Analyse van de siRNA knock-down De expressie van CCL17 werd gecontroleerd met behulp van kwantitatieve real-time PCR om de rol van de transcriptionele activator STAT6 onderzoeken in IL-4 afhankelijke inductie van CCL17. Voor dit experiment werd GAPDH gebruikt als een referentie-gen. Alternatieve referentie-genen of meerdere referentie-genen kunnen worden gebruikt op dezelfde manier. De CFX Manager-software automatisch genormaliseerd CCL17 expressie om expressie van het referentie-gen van hetzelfde monster en automatisch vergeleken de resulterende genormaliseerde waarden op behandelingen bedienen door eenvoudig te selecteren GAPDH als "referentie" en de controle behandeling (controle siRNA zonder IL-4 inductie) als "controle" in het experiment instellingen venster van de CFX manager software. Zonder IL-4 inductie, transcriptie van CCL17 bleef op een laag, constitutieve niveaus die vergelijkbaar zijn met de controle-behandeling. Cellen geïnduceerd met IL-4 en behouden van een normale STAT6 pad (dat wil zeggen, controle siRNA of ongetransfecteerde controle behandelingen) toonde 8-10 maal inductie van CCL17 expressie. Cellen geïnduceerd met IL-4, maar met STAT6 uitdrukking geremd door de introductie van een van beide STAT6 siRNA bleek slechts ongeveer twee maal hoger CCL17 expressie dan de niet-geïnduceerde cellen bevestiging van de rol van STAT6 in de IL-4 geïnduceerde expressie van CCL17. 6. Representatieve resultaten Figuur 1. Overzicht van de IL-4 signaalweg. A) Binding van IL-4 aan de receptor leidt tot dimerisatie en activering van STAT6. Geactiveerd STAT6 naar de kern en activeert transcriptie van zijn doel genen, zoals CC17. B) zonder IL-4 inductie, zal de transcriptie van CCL17 blijven op een laag, constitutief niveaus. C) Na siRNA-gemedieerde zwijgen van de STAT6 gen, moet de behandeling met IL4 leiden tot weinig of geen toename van CCL17 expressie. Figuur 2. Inductie van CCL17 door IL4 gemeten door verschillende omstandigheden met behulp van kwantitatieve real-time PCR. A) monsters geteeld zonder IL-4 had een lage constitutieve niveau van expressie, ongeacht van genexpressie. B) Zoals in groen en blauw, controlemonsters reageerde normaal op de behandeling met IL-4, met een 8-10 maal inductie van CCL17. Echter, cellen getransfecteerd met siRNA gericht op STAT6, weergegeven in rood en roze, had verminderd CCL17 expressie in reactie op IL-4, het ondersteunen van het idee dat STAT6 speelt een rol in de IL-4 geïnduceerde expressie van CCL17.
