La disección y la Cultura de las neuronas comisurales de médula espinal embrionaria
Summary
Este vídeo demuestra un método para analizar la cultura y las neuronas de la comisura de la médula espinal de ratas E13 dorsal. Disociada neuronas comisurales son útiles para estudiar los mecanismos celulares y moleculares de crecimiento axonal y orientación.
Abstract
Las neuronas comisurales han sido ampliamente utilizados para investigar los mecanismos subyacentes de guiado de los axones durante el desarrollo embrionario de la médula espinal. Los cuerpos celulares de estas neuronas se encuentran en la médula espinal dorsal y sus axones siguen trayectorias estereotipados durante el desarrollo embrionario. Axones de la comisura ventral proyecto inicialmente a la placa del piso. Después de cruzar la línea media, estos axones a su vez hacia adelante y proyectarse hacia el cerebro. Cada uno de estos pasos está regulado por la acción de las señales de orientación varias. Culturas altamente enriquecido en las neuronas comisurales son ideales para muchos experimentos abordar los mecanismos de pathfinding axón, incluidos los ensayos de inflexión, inmunoquímica y bioquímica. Aquí se describe un método para analizar la cultura y las neuronas de la comisura de la médula espinal de ratas E13 dorsal. En primer lugar, la médula espinal está aislado y tiras dorsales son diseccionados. El tejido dorsal luego se disocia en una suspensión de células por tripsinización y disrupción mecánica. Las neuronas son sembradas en cubreobjetos de vidrio con poli-L-lisina o placas de cultivo de tejidos. Después de 30 horas<em> In vitro</em>, La mayoría de las neuronas se han extendido de un axón. La pureza de la cultura (Yam<em> Et al.</em> 2009), por lo general más del 90%, puede ser evaluada por inmunomarcaje con la neurona de la comisura DCC marcadores, LH2 y TAG1 (Helms y Johnson, 1998). Esta preparación neuronal es una herramienta útil para<em> In vitro</em> Estudios de los mecanismos celulares y moleculares de crecimiento de los axones comisurales y orientación durante el desarrollo de la médula espinal.
Protocol
Discussion
Se ha descrito un método para analizar la cultura y las neuronas de la comisura de la médula espinal de ratas embrionarias. Este procedimiento ha sido de uso habitual en nuestro laboratorio para preparar de forma fiable las neuronas para estudiar los mecanismos celulares y moleculares de guiado de los axones. Para la biología celular y los experimentos inmunoquímica, la disección de una camada produce neuronas suficientes. Cuando se necesitan más células, como en muchos experimentos de bioquímica, la disección …
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por becas de los Institutos Canadienses de Investigación en Salud (CIHR), el Peter Lougheed Fundación de Investigación Médica, el Programa de McGill en Neuroingeniería, el Fonds de Recherche en Santé du Québec (FRSQ), y la Fundación Canadiense para la Innovación (CFI ). Sébastien D. Langlois fue apoyado por el Premio de Formación de Maestría de la Fonds de la recherche en santé du Québec (FRSQ) y por Frederick Banting y Charles Best Premio de Canadá de Postgrado Becas de Maestría de los Institutos Canadienses de Investigación en Salud (CIHR). Estamos muy agradecidos a Jessica MT Pham de asistencia y cifras.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Neurobasal medium, liquid | Invitrogen | 21103-049 | See Recipes and Comments | |
| B27 supplement 50X | Invitrogen | 17504 | See Recipes and Comments | |
| Poly-L-lysine 0.01% solution | Sigma | P4707 | ||
| L-15 medium, powder | Invitrogen | 41300-070 | ||
| Trypsin 2.5% (10X) | Invitrogen | 15090-046 | ||
| DNAse I, 25000 U/mL | Worthington | |||
| MgSO4 | Sigma | M2643 | ||
| HBSS, Ca2+/Mg2+-free | Invitrogen | 14170-112 | ||
| L-glutamine 200mM, liquid | Invitrogen | 25030-081 | See Recipes and Comments |
Dissection of embryonic rat dorsal spinal cord (see also Table I)
- E13 pregnancy-staged rat
- Ethanol 70%
- Surgical scissors, Fine Science Tools
- Forceps, Dumont #5, Fine Science Tools
- Petri dishes
- L-15 medium
- Dissection microscope, Leica
- Plastic transfer pipettes
- Microscissors, Fine Science Tools
- Tungsten needles and pin holders (one hook-shaped needle, one L-shapes needle, one straight needle), Fine Science Tools
- Heat-inactivated Horse Serum (HiHS)
- 15 ml plastic tubes
Commissural neuron culture (see also Table I)
- Tissue culture incubators (37°C, 5% CO2, humidity controlled)
- German Desag glass coverslips and/or plastic tissue culture dishes
- Poly-L-lysine, Sigma
- Sterile milliQ H2O
- Neurobasal, Invitrogen
- Heat-inactivated Fetal Bovine Serum (HiFBS)
- L-Glutamine
- B27, Invitrogen
- Penicillin/Streptomycin antibiotics
- 37°C waterbath
- Sterile Pasteur Pipettes
- Bunsen gas burner
- HBSS, Ca2+/Mg2+-free, Invitrogen
- DNAse, Worthington
- MgSO4
- Centrifuge
- Hemacytometer
- Trypan Blue Solution
Referencias
- Charron, F., Stein, E., Jeong, J., McMahon, A. P., Tessier-Lavigne, M. The morphogen sonic hedgehog is an axonal chemoattractant that collaborates with netrin-1 in midline axon guidance. Cell. , 113-1111 (2003).
- Fabre, P., Shimogori, T., Charron, F. Segregation of ipsilateral retinal ganglion cell axons at the optic chiasm requires the Shh Receptor Boc. Journal of Neuroscience. 30, 266-275 (2010).
- Helms, A. W., Johnson, J. E. Progenitors of dorsal commissural interneurons are defined by MATH1 expression. Development. 125, 919-928 (1998).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nature Protocols. 1, 2406-2415 (2006).
- Okada, A., Charron, F., Morin, S., Shin, D. S., Wong, K., Fabre, P. J., Tessier-Lavigne, M., McConnell, S. K. Boc is a receptor for sonic hedgehog in the guidance of commissural axons. Nature. 444, 369-373 (2006).
- Yam, P. T., Langlois, S. D., Morin, S., Charron, F. Sonic hedgehog guides axons through a noncanonical, Src-family-kinase-dependent signaling pathway. Neuron. 62, 349-362 (2009).
