تشريح والثقافة من الخلايا العصبية من النخاع الشوكي صواري الجنينية
Summary
هذا الفيديو يوضح طريقة لتشريح والثقافة الخلايا العصبية صواري E13 من الحبل الشوكي الفئران الظهرية. فصل الخلايا العصبية صواري مفيدة لدراسة الآليات الخلوية والجزيئية للنمو محور عصبي والتوجيه.
Abstract
وقد استخدمت على نطاق واسع صواري الخلايا العصبية للتحقيق في الآليات الكامنة وراء التوجيه محوار خلال تطور الجنين في الحبل الشوكي. توجد أجسام الخلايا العصبية في هذه النخاع الشوكي الظهري والمحاور التي تتبع المسارات النمطية أثناء التطور الجنيني. محاور المشروع في البداية صواري ventrally نحو floorplate. بعد عبور خط الوسط ، وهذه المحاور الأمامية وتحويل المشروع نحو الدماغ. ينظم كل من هذه الخطوات التي عمل عدة اشارات التوجيه. هي مناسبة بشكل مثالي الثقافات عالي التخصيب في الخلايا العصبية صواري لمعالجة العديد من التجارب آليات محوار الاستطلاعية ، بما في ذلك فحوصات تحول ، كيمياء المناعة والكيمياء الحيوية. هنا ، نحن تصف طريقة لتشريح والثقافة الخلايا العصبية صواري E13 من الحبل الشوكي الفئران الظهرية. الأول ، هو عزل النخاع الشوكي وتشريح شرائط الظهرية بها. النسيج الظهرية ومن ثم فصلها الى تعليق خلية trypsinization واضطراب الميكانيكية. ومطلي على الخلايا العصبية coverslips الزجاج بولي – L – يسين المغلفة أو أطباق الأنسجة الثقافة. بعد 30 ساعة<em> في المختبر</em> ، وقد مددت معظم الخلايا العصبية محور عصبي. نقاء الثقافة (يام<em> وآخرون.</em> 2009) ، وعادة ما يزيد على 90 ٪ ، يمكن تقييم من قبل immunolabeling مع DCC عصبون علامات صواري ، وLH2 TAG1 (هيلمز وجونسون ، 1998). هذا التحضير العصبية هي أداة مفيدة ل<em> في المختبر</em> دراسات الآليات الخلوية والجزيئية للنمو محوار صواري والتوجيه أثناء تطوير الحبل الشوكي.
Protocol
Discussion
وقد وصف لنا طريقة لتشريح والثقافة صواري الخلايا العصبية من الحبل الشوكي الفئران الجنينية. وقد تم هذا الإجراء تستخدم بشكل روتيني في مختبرنا لإعداد موثوق الخلايا العصبية لدراسة الآليات الخلوية والجزيئية التوجيه محور عصبي. لبيولوجيا الخلية وتجارب كيمياء مناعية ، تشر?…
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من المعاهد الكندية للأبحاث الصحية (CIHR) ، وبيتر Lougheed للبحوث الطبية ، ومؤسسة برنامج ماكجيل في Neuroengineering ، وفون بحوث دي سانتي ان كيبيك (FRSQ) ، والمؤسسة الكندية للابتكار (CFI ). وأيد سيباستيان دي انجلوا لجائزة التدريب على الماجستير من فون دي سانتي LA RECHERCHE EN كيبيك (FRSQ) وقبل فريدريك وتشارلز بانتينغ جائزة أفضل رسالة ماجستير كندا منح دراسات عليا من المعهد الكندي للبحوث الصحية (CIHR). ونحن ممتنون لجيسيكا MT فام للحصول على المساعدة وأرقام.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Neurobasal medium, liquid | Invitrogen | 21103-049 | See Recipes and Comments | |
| B27 supplement 50X | Invitrogen | 17504 | See Recipes and Comments | |
| Poly-L-lysine 0.01% solution | Sigma | P4707 | ||
| L-15 medium, powder | Invitrogen | 41300-070 | ||
| Trypsin 2.5% (10X) | Invitrogen | 15090-046 | ||
| DNAse I, 25000 U/mL | Worthington | |||
| MgSO4 | Sigma | M2643 | ||
| HBSS, Ca2+/Mg2+-free | Invitrogen | 14170-112 | ||
| L-glutamine 200mM, liquid | Invitrogen | 25030-081 | See Recipes and Comments |
Dissection of embryonic rat dorsal spinal cord (see also Table I)
- E13 pregnancy-staged rat
- Ethanol 70%
- Surgical scissors, Fine Science Tools
- Forceps, Dumont #5, Fine Science Tools
- Petri dishes
- L-15 medium
- Dissection microscope, Leica
- Plastic transfer pipettes
- Microscissors, Fine Science Tools
- Tungsten needles and pin holders (one hook-shaped needle, one L-shapes needle, one straight needle), Fine Science Tools
- Heat-inactivated Horse Serum (HiHS)
- 15 ml plastic tubes
Commissural neuron culture (see also Table I)
- Tissue culture incubators (37°C, 5% CO2, humidity controlled)
- German Desag glass coverslips and/or plastic tissue culture dishes
- Poly-L-lysine, Sigma
- Sterile milliQ H2O
- Neurobasal, Invitrogen
- Heat-inactivated Fetal Bovine Serum (HiFBS)
- L-Glutamine
- B27, Invitrogen
- Penicillin/Streptomycin antibiotics
- 37°C waterbath
- Sterile Pasteur Pipettes
- Bunsen gas burner
- HBSS, Ca2+/Mg2+-free, Invitrogen
- DNAse, Worthington
- MgSO4
- Centrifuge
- Hemacytometer
- Trypan Blue Solution
Referencias
- Charron, F., Stein, E., Jeong, J., McMahon, A. P., Tessier-Lavigne, M. The morphogen sonic hedgehog is an axonal chemoattractant that collaborates with netrin-1 in midline axon guidance. Cell. , 113-1111 (2003).
- Fabre, P., Shimogori, T., Charron, F. Segregation of ipsilateral retinal ganglion cell axons at the optic chiasm requires the Shh Receptor Boc. Journal of Neuroscience. 30, 266-275 (2010).
- Helms, A. W., Johnson, J. E. Progenitors of dorsal commissural interneurons are defined by MATH1 expression. Development. 125, 919-928 (1998).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nature Protocols. 1, 2406-2415 (2006).
- Okada, A., Charron, F., Morin, S., Shin, D. S., Wong, K., Fabre, P. J., Tessier-Lavigne, M., McConnell, S. K. Boc is a receptor for sonic hedgehog in the guidance of commissural axons. Nature. 444, 369-373 (2006).
- Yam, P. T., Langlois, S. D., Morin, S., Charron, F. Sonic hedgehog guides axons through a noncanonical, Src-family-kinase-dependent signaling pathway. Neuron. 62, 349-362 (2009).
