Murina Modell av CD40-aktivering av B-celler
Summary
I denna video visar vi förfarandet för CD40-aktivering och expansion av murina B-celler från splenocytes av C57BL / 6 möss, som kan användas som en modell antigen-presenterande celler (APC) att studera induktion av immunitet.
Abstract
Forskning om B-celler har visat att CD40 aktivering förbättrar deras kapacitet antigen presentation. När stimuleras med interleukin-4 och CD40 ligand (CD40L) kan mänskliga B-celler utökas utan svårigheter från små mängder av perifert blod inom 14 dagar till mycket stora mängder högt ren CD40-B-celler (> 10<sup> 9</sup> Celler per patient) från friska donatorer och patienter med cancer<sup> 1-4</sup>. CD40-B-celler uttrycker viktiga lymfkörtel målsökande molekyler och kan locka T-celler<em> In vitro</em<sup> 5</sup>. Dessutom tar de effektivt upp, bearbeta och presentera antigener för T-celler<sup> 6,7</sup>. CD40-B-celler visades inte bara prime naiva, men också utöka celler minne T<sup> 8,9</sup>. Därför CD40-aktiverade B-celler (CD40-B-celler) har studerats som en alternativ källa av immuno-stimulerande antigen-presenterande celler (APC) för cellbaserade immunotherapy1, 5,10. För att ytterligare studera om CD40-B-celler inducerar effektivt T-cell reaktioner in vivo och att studera den underliggande mekanismen vi etablerat ett system cellkultur för generering av murina CD40-aktiverade B-celler. Använda splenocytes eller renat B-celler från C57BL / 6 möss för CD40-aktivering, var optimala förhållanden identifieras enligt följande: Från splenocytes av C57BL / 6 möss (haplotyp H-2b) lymfocyter renas genom densitetsgradient centrifugering och co-odlade med HeLa celler som uttrycker rekombinant murin CD40 ligand (tmuCD40L HeLa)<sup> 11</sup>. Celler är recultured var 3-4 dagar och nyckelkomponenter såsom CD40L, interleukin-4,-Mercaptoethanol och cyklosporin A fylls. I detta protokoll visar vi hur du får fullt aktiverad murin CD40-B-celler (mCD40B) med liknande APC-fenotyp för människors CD40-B-celler (Figur 1a, b). CD40-stimulering leder till en snabb utväxt och utbyggnad av mycket rent (> 90%) CD19 + B-celler inom 14 dagar från cellodling (fig 1c, d). Att undvika kontaminering med icke-transfekterade celler, har uttryck av murina CD40 ligand på transfectants som ska kontrolleras regelbundet (Fig. 2). Murina CD40-aktiverade B-celler kan användas för att studera B-cells aktivering och differentiering, samt att undersöka deras möjligheter att fungera som APC in vitro och in vivo. Dessutom utgör de ett lovande verktyg för att skapa terapeutiska eller förebyggande vaccinering mot tumörer och hjälper till att svara på frågor om säkerhet och immunogenicitet av denna strategi<sup> 12</sup>.
Protocol
Discussion
Ändringar av detta protokoll är möjliga, särskilt när det gäller ursprunget till CD40-stimulans och vilken typ av mus stam som används, även ger en effektiv generering av murina CD40-aktiverade B-celler. Ahmadi et al. har visat liknande resultat för musfibroblaster transfererats med murina CD40-ligand. I detta sammanhang presentation av xeno-antigen kan uteslutas med säkerhet, men intensiva studier avseende säkerhet och toxicitet in vivo gav inga tecken på inflammation eller autoimmunitet reaktion i…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar vänligt Dr Clemens Wendtner för att ge tmuCD40-ligand-HeLa cellinje.
Materials
A. Preparation of Media:
| Feeder cell wild type medium | Feeder cell selection medium | ||
| Reagent | Concentration | Reagent | Concentration |
| RPMI 1640 | RPMI 1640 | ||
| L-Glutamine | 300 μg/mL | L-Glutamine | 300 μg/mL |
| FBS | 10 % | FBS | 10 % |
| HEPES | 10 mM | HEPES | 10 mM |
| Gentamycin | 15 μg/mL | Gentamycin | 15 μg/mL |
| Hygromycin B | 0.2 mg/mL |
| mCD40-B washing medium | mCD40-B culture medium | ||
| Reagent | Concentration | Reagent | Concentration |
| D-MEM | |
D-MEM | |
| L-Glutamine | 580 μg/mL | L-Glutamine | 580 μg/mL |
| Glucose | 4.5 mg/mL | Glucose | 4.5 mg/mL |
| HEPES | 10 mM | HEPES | 10 mM |
| Gentamycin | 15 μg/mL | Gentamycin | 15 μg/mL |
| MEM | 0.1mM (1x) | ||
| FBS | 10% |
B. Miscellaneous Reagents:
| Reagent | Company | Order No |
| RPMI 1640 | Invitrogen Gibco® | REF 21875 |
| D-MEM | Invitrogen Gibco® | REF 41965 |
| Dulbecco´s PBS (10x) | PAA | Cat No H15-011 |
| Gencin® | Delta Select | Art No 7395800 |
| FBS | LONZA | Cat No DE14-802C |
| HEPES Buffer | PAA | Cat No S11-001 |
| MEM NEAA | Invitrogen Gibco® | REF 11140 |
| Hygromycin B | PAA | Cat No P02-015 |
| Recombinant Murine Interleukin-4 | Immunotools | Cat No 12340045 |
| Cyclosporin A | Novartis | Cat No NDC 0078-0109-01 |
| Trypsin/EDTA (10x) | Invitrogen Gibco® | REF 15400-054 |
C. Miscellaneous Supplies:
| Reagent | Company | Order No |
| Sterile pipette tips | Sarstedt | |
| 6-well plate | NUNC | Cat No 140675 |
| 50mL conical tube | BD Falcon™ | Cat No 352070 |
| Tissue culture flask | Sarstedt | Cat No 83.1813.002 |
Referencias
- Schultze, J. L. CD40-activated human B cells: an alternative source of highly efficient antigen presenting cells to generate autologous antigen-specific T cells for adoptive immunotherapy. J Clin Invest. 100 (11), 2757-2765 (1997).
- Wiesner, M. Conditional immortalization of human B cells by CD40 ligation. PLoS ONE. 3, e1464-e1464 (2008).
- Kondo, E. Efficient generation of antigen-specific cytotoxic T cells using retrovirally transduced CD40-activated B cells. J Immunol. 169 (4), 2164-2171 (2002).
- Liebig, T. M., Fiedler, A., Zoghi, S., Shimabukuro-Vornhagen, A., Bergwelt-Baildon, M. S. Generation of human CD40-activated B cells. J Vis Exp. 32, (2009).
- von Bergwelt-Baildon, M. CD40-activated B cells express full lymph node homing triad and induce T-cell chemotaxis: potential as cellular adjuvants. Blood. 107 (7), 2786-2789 (2006).
- Lapointe, R., Bellemare-Pelletier, A., Housseau, F., Thibodeau, J., Hwu, P. CD40-stimulated B lymphocytes pulsed with tumor antigens are effective antigen-presenting cells that can generate specific T cells. Cancer Res. 63 (11), 2836-2843 (2003).
- Ahmadi, T., Flies, A., Efebera, Y., Sherr, D. H. CD40 Ligand-activated, antigen-specific B cells are comparable to mature dendritic cells in presenting protein antigens and major histocompatibility complex class I- and class II-binding peptides. Immunology. 124 (1), 129-140 (2008).
- Bergwelt-Baildon, M. S. v. o. n. Human primary and memory cytotoxic T lymphocyte responses are efficiently induced by means of CD40-activated B cells as antigen-presenting cells: potential for clinical application. Blood. 99 (9), 3319-3325 (2002).
- Kondo, E. CD40-activated B cells can be generated in high number and purity in cancer patients: analysis of immunogenicity and homing potential. Clin Exp Immunol. 155 (2), 249-256 (2009).
- Schultze, J. L., Grabbe, S., von Bergwelt-Baildon, M. S. DCs and CD40-activated B cells: current and future avenues to cellular cancer immunotherapy. Trends Immunol. 25 (12), 659-664 (2004).
- Mayr, C. Chromosomal translocations are associated with poor prognosis in chronic lymphocytic leukemia. Blood. 107 (2), 742-751 (2006).
- Mason, N. J. RNA-loaded CD40-activated B cells stimulate antigen-specific T-cell responses in dogs with spontaneous lymphoma. Gene Ther. 15 (13), 955-965 (2008).
