Modelo murino de CD40-activación de las células B
Summary
En este video, que demuestre el procedimiento de activación CD40-y la expansión de las células B murinas a partir de esplenocitos de ratones C57BL / 6, que puede ser utilizado como un modelo de célula presentadora de antígeno (APC) para estudiar la inducción de la inmunidad.
Abstract
La investigación sobre células B CD40 ha demostrado que mejora la capacidad de activación de la presentación de antígenos. Cuando se estimula con la interleucina-4 y CD40 ligando (CD40L), las células B se puede ampliar sin problemas a partir de pequeñas cantidades de sangre periférica dentro de 14 días a cantidades muy grandes de muy pura de células B CD40-(> 10<sup> 9</sup> Células por paciente) de donantes sanos, así como los pacientes con cáncer<sup> 4.1</sup>. Las células CD40-B expresan importantes moléculas mensajeras de los ganglios linfáticos y puede atraer a las células T<em> In vitro</em<sup> 5</sup>. Además se ocupan de manera eficiente, procesar y presentar antígenos a los linfocitos T<sup> 6,7</sup>. Las células CD40-B mostraron no sólo ingenuo principal, sino también ampliar las células T de memoria<sup> 8,9</sup>. Por lo tanto-CD40 activan las células B (CD40-células B) se han estudiado como una fuente alternativa de inmuno-estimulantes de células presentadoras de antígeno (APC) para celulares basado en immunotherapy1, 5,10. Con el fin de estudiar más a fondo si las células CD40-B induce respuestas eficaces de las células T in vivo y para estudiar el mecanismo subyacente que estableció un sistema de cultivo celular para la generación de células B CD40 murino activado. Utilizando esplenocitos o purificada células B de ratones C57BL / 6 para la activación de CD40-, las condiciones óptimas fueron identificados de la siguiente manera: A partir de esplenocitos de ratones C57BL / 6 (haplotipo H-2b) los linfocitos se purificaron por centrifugación en gradiente de densidad y co-cultivadas con células HeLa células que expresan el ligando de CD40 murino recombinante (tmuCD40L HeLa)<sup> 11</sup>. Las células son recultured cada 3-4 días y los componentes clave, tales como CD40L, la interleucina-4,-mercaptoetanol y ciclosporina A se repone. En este protocolo se demuestra cómo obtener completamente activado murino CD40-células B (mCD40B) con similares APC-fenotipo en humanos CD40-células B (Fig. 1a, b). CD40-estimulación conduce a un resultado rápido y la expansión de alta pureza (> 90%) las células B CD19 + en los 14 días de cultivo de células (Fig. 1c, d). Para evitar la contaminación con células no transfectadas, la expresión del ligando de CD40 murino en los transfectantes tiene que ser controlado regularmente (Fig. 2). Murino CD40-linfocitos B activados se pueden utilizar para estudiar activación de células B y la diferenciación, así como para investigar su potencial para funcionar como APC in vitro e in vivo. Además, representan una herramienta prometedora para el establecimiento de la vacunación terapéutica o preventiva contra los tumores y le ayudará a responder a las preguntas relativas a la seguridad y la inmunogenicidad de este enfoque<sup> 12</sup>.
Protocol
Discussion
Las modificaciones de este protocolo son posibles, especialmente en relación con el origen de CD40-estímulo y el tipo de cepa de ratón utilizada, también está dando en la generación eficiente de las células B CD40 murino activado. Ahmadi et al. han mostrado resultados similares para los fibroblastos de ratón transfectadas con CD40 murino-ligando. En este contexto de la presentación de xeno-antígeno puede ser excluido con certeza, pero los estudios intensivos sobre la seguridad y la toxicidad in vivo n…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Amablemente las gracias al Dr. Clemens Wendtner para proporcionar tmuCD40-ligando línea celular HeLa.
Materials
A. Preparation of Media:
| Feeder cell wild type medium | Feeder cell selection medium | ||
| Reagent | Concentration | Reagent | Concentration |
| RPMI 1640 | RPMI 1640 | ||
| L-Glutamine | 300 μg/mL | L-Glutamine | 300 μg/mL |
| FBS | 10 % | FBS | 10 % |
| HEPES | 10 mM | HEPES | 10 mM |
| Gentamycin | 15 μg/mL | Gentamycin | 15 μg/mL |
| Hygromycin B | 0.2 mg/mL |
| mCD40-B washing medium | mCD40-B culture medium | ||
| Reagent | Concentration | Reagent | Concentration |
| D-MEM | |
D-MEM | |
| L-Glutamine | 580 μg/mL | L-Glutamine | 580 μg/mL |
| Glucose | 4.5 mg/mL | Glucose | 4.5 mg/mL |
| HEPES | 10 mM | HEPES | 10 mM |
| Gentamycin | 15 μg/mL | Gentamycin | 15 μg/mL |
| MEM | 0.1mM (1x) | ||
| FBS | 10% |
B. Miscellaneous Reagents:
| Reagent | Company | Order No |
| RPMI 1640 | Invitrogen Gibco® | REF 21875 |
| D-MEM | Invitrogen Gibco® | REF 41965 |
| Dulbecco´s PBS (10x) | PAA | Cat No H15-011 |
| Gencin® | Delta Select | Art No 7395800 |
| FBS | LONZA | Cat No DE14-802C |
| HEPES Buffer | PAA | Cat No S11-001 |
| MEM NEAA | Invitrogen Gibco® | REF 11140 |
| Hygromycin B | PAA | Cat No P02-015 |
| Recombinant Murine Interleukin-4 | Immunotools | Cat No 12340045 |
| Cyclosporin A | Novartis | Cat No NDC 0078-0109-01 |
| Trypsin/EDTA (10x) | Invitrogen Gibco® | REF 15400-054 |
C. Miscellaneous Supplies:
| Reagent | Company | Order No |
| Sterile pipette tips | Sarstedt | |
| 6-well plate | NUNC | Cat No 140675 |
| 50mL conical tube | BD Falcon™ | Cat No 352070 |
| Tissue culture flask | Sarstedt | Cat No 83.1813.002 |
Referencias
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- Bergwelt-Baildon, M. S. v. o. n. Human primary and memory cytotoxic T lymphocyte responses are efficiently induced by means of CD40-activated B cells as antigen-presenting cells: potential for clinical application. Blood. 99 (9), 3319-3325 (2002).
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