דגם Murine של הפעלת-CD40 בתאי B
Summary
בסרטון הזה, אנחנו מדגימים את התהליך של הפעלת-CD40 והרחבה של תאים B Murine מ splenocytes של C57BL / 6 עכברים, אשר יכול לשמש תא מודל אנטיגן מציג (APC) ללמוד אינדוקציה של חסינות.
Abstract
המחקר על תאים B הוכיחו כי CD40 ההפעלה משפר את יכולת הצגת האנטיגן שלהן. כאשר מגורה עם interleukin-4 ו CD40 ליגנד (CD40L), תאים B האדם ניתן להרחיב ללא קשיים של כמויות קטנות של דם היקפיים בתוך 14 ימים על כמויות גדולות מאוד של הפערים טהור CD40-B תאים (> 10<sup> 9</sup> התאים לחולה) מתורמים בריאים, כמו גם חולי סרטן<sup> 1-4</sup>. תאים CD40-B להביע חשוב הלימפה מולקולות ביות והוא יכול למשוך ותאי T<em> במבחנה</em<sup> 5</sup>. יתר על כן הם תופסים ביעילות, תהליך להציג אנטיגנים לתאי T<sup> 6,7</sup>. תאים CD40-B הוצגו נאיבי לא רק הממשלה, אלא גם להרחיב את הזיכרון T לתאים<sup> 8,9</sup>. לכן CD40 המופעל בתאי B (CD40-B תאים) נחקרו כמקור חלופי חיסונית של גירוי התאים המציגים אנטיגנים (APC) עבור מבוססי תאים immunotherapy1, 5,10. כדי ללמוד עוד אם התאים CD40-B לגרום האפקטיבית התגובות תא T in vivo ו ללמוד את המנגנון הבסיסי הקמנו מערכת תרבית תאים עבור הדור של CD40 המופעל בתאים Murine B. שימוש splenocytes או מטוהרים תאים B מעכברים C57BL / 6 להפעלה CD40, תנאים אופטימליים זוהו כדלקמן: החל מ splenocytes של C57BL / 6 עכברים (haplotype H-2B) לימפוציטים הם מטוהרים על ידי צנטריפוגה צפיפות שיפוע ושיתוף תרבותי עם הלה תאים להביע רקומביננטי Murine CD40 ליגנד (tmuCD40L הלה)<sup> 11</sup>. תאים הם recultured כל 3-4 ימים רכיבי מפתח כגון CD40L, interleukin-4, ו-Mercaptoethanol ציקלוספורין הם מתחדש. בפרוטוקול זה אנו מדגימים כיצד להשיג מופעל במלואו Murine CD40-B תאים (mCD40B) עם פנוטיפ דומה APC-CD40 ל-B תאים אנושיים (איור 1 א, ב). CD40-גירוי מוביל תולדה מהיר והרחבת טהורים ביותר (> 90%) CD19 + B תאים בתוך 14 ימים של תרבית תאים (איור 1 ג, ד). כדי למנוע זיהום עם הלא transfected תאים, ביטוי של ליגנד CD40 Murine על transfectants חייב להיות מבוקר באופן קבוע (איור 2). Murine CD40 המופעל בתאי B יכול לשמש כדי ללמוד B-cell הפעלה התמיינות, וכן לחקור את הפוטנציאל שלהם לתפקד APC במבחנה in vivo. יתר על כן, הם מייצגים כלי מבטיח עבור יצירת חיסון או טיפול מונע נגד גידולים יסייע לענות על שאלות לגבי בטיחות immunogenicity של גישה זו<sup> 12</sup>.
Protocol
Discussion
שינויים של פרוטוקול זה אפשרי, במיוחד לגבי מקורו של הגירוי-CD40 ואת סוג של זן העכבר משמש, גם מניב בדור יעילה של תאים Murine CD40-B מופעל. אחמדי et al. הראו תוצאות דומות עבור fibroblasts העכבר transfected עם Murine-CD40 ליגנד. במצגת זו בהקשר של אנטיגן קסנו ניתן לשלול בוודאות, אך מחקרים אינטנסיביים ?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מבקשים להודות לד"ר קלמנס Wendtner למתן tmuCD40-ליגנד, הלה קו התא.
Materials
A. Preparation of Media:
| Feeder cell wild type medium | Feeder cell selection medium | ||
| Reagent | Concentration | Reagent | Concentration |
| RPMI 1640 | RPMI 1640 | ||
| L-Glutamine | 300 μg/mL | L-Glutamine | 300 μg/mL |
| FBS | 10 % | FBS | 10 % |
| HEPES | 10 mM | HEPES | 10 mM |
| Gentamycin | 15 μg/mL | Gentamycin | 15 μg/mL |
| Hygromycin B | 0.2 mg/mL |
| mCD40-B washing medium | mCD40-B culture medium | ||
| Reagent | Concentration | Reagent | Concentration |
| D-MEM | |
D-MEM | |
| L-Glutamine | 580 μg/mL | L-Glutamine | 580 μg/mL |
| Glucose | 4.5 mg/mL | Glucose | 4.5 mg/mL |
| HEPES | 10 mM | HEPES | 10 mM |
| Gentamycin | 15 μg/mL | Gentamycin | 15 μg/mL |
| MEM | 0.1mM (1x) | ||
| FBS | 10% |
B. Miscellaneous Reagents:
| Reagent | Company | Order No |
| RPMI 1640 | Invitrogen Gibco® | REF 21875 |
| D-MEM | Invitrogen Gibco® | REF 41965 |
| Dulbecco´s PBS (10x) | PAA | Cat No H15-011 |
| Gencin® | Delta Select | Art No 7395800 |
| FBS | LONZA | Cat No DE14-802C |
| HEPES Buffer | PAA | Cat No S11-001 |
| MEM NEAA | Invitrogen Gibco® | REF 11140 |
| Hygromycin B | PAA | Cat No P02-015 |
| Recombinant Murine Interleukin-4 | Immunotools | Cat No 12340045 |
| Cyclosporin A | Novartis | Cat No NDC 0078-0109-01 |
| Trypsin/EDTA (10x) | Invitrogen Gibco® | REF 15400-054 |
C. Miscellaneous Supplies:
| Reagent | Company | Order No |
| Sterile pipette tips | Sarstedt | |
| 6-well plate | NUNC | Cat No 140675 |
| 50mL conical tube | BD Falcon™ | Cat No 352070 |
| Tissue culture flask | Sarstedt | Cat No 83.1813.002 |
Referencias
- Schultze, J. L. CD40-activated human B cells: an alternative source of highly efficient antigen presenting cells to generate autologous antigen-specific T cells for adoptive immunotherapy. J Clin Invest. 100 (11), 2757-2765 (1997).
- Wiesner, M. Conditional immortalization of human B cells by CD40 ligation. PLoS ONE. 3, e1464-e1464 (2008).
- Kondo, E. Efficient generation of antigen-specific cytotoxic T cells using retrovirally transduced CD40-activated B cells. J Immunol. 169 (4), 2164-2171 (2002).
- Liebig, T. M., Fiedler, A., Zoghi, S., Shimabukuro-Vornhagen, A., Bergwelt-Baildon, M. S. Generation of human CD40-activated B cells. J Vis Exp. 32, (2009).
- von Bergwelt-Baildon, M. CD40-activated B cells express full lymph node homing triad and induce T-cell chemotaxis: potential as cellular adjuvants. Blood. 107 (7), 2786-2789 (2006).
- Lapointe, R., Bellemare-Pelletier, A., Housseau, F., Thibodeau, J., Hwu, P. CD40-stimulated B lymphocytes pulsed with tumor antigens are effective antigen-presenting cells that can generate specific T cells. Cancer Res. 63 (11), 2836-2843 (2003).
- Ahmadi, T., Flies, A., Efebera, Y., Sherr, D. H. CD40 Ligand-activated, antigen-specific B cells are comparable to mature dendritic cells in presenting protein antigens and major histocompatibility complex class I- and class II-binding peptides. Immunology. 124 (1), 129-140 (2008).
- Bergwelt-Baildon, M. S. v. o. n. Human primary and memory cytotoxic T lymphocyte responses are efficiently induced by means of CD40-activated B cells as antigen-presenting cells: potential for clinical application. Blood. 99 (9), 3319-3325 (2002).
- Kondo, E. CD40-activated B cells can be generated in high number and purity in cancer patients: analysis of immunogenicity and homing potential. Clin Exp Immunol. 155 (2), 249-256 (2009).
- Schultze, J. L., Grabbe, S., von Bergwelt-Baildon, M. S. DCs and CD40-activated B cells: current and future avenues to cellular cancer immunotherapy. Trends Immunol. 25 (12), 659-664 (2004).
- Mayr, C. Chromosomal translocations are associated with poor prognosis in chronic lymphocytic leukemia. Blood. 107 (2), 742-751 (2006).
- Mason, N. J. RNA-loaded CD40-activated B cells stimulate antigen-specific T-cell responses in dogs with spontaneous lymphoma. Gene Ther. 15 (13), 955-965 (2008).
