Mausmodell der CD40-Aktivierung von B-Zellen
Summary
In diesem Video zeigen wir, das Verfahren der CD40-Aktivierung und Expansion von murinen B-Zellen aus Splenozyten von C57BL / 6 Mäusen, die als Modell-Antigen-präsentierende Zellen (APC) zur Induktion der Immunität Studie verwendet werden können.
Abstract
Forschung auf B-Zellen haben gezeigt, dass CD40-Aktivierung ihrer Antigen-Präsentation Kapazität verbessert. Wenn mit Interleukin-4 und CD40-Ligand (CD40L) stimuliert, kann das menschliche B-Zellen ohne Schwierigkeiten von kleinen Mengen von peripheren Blut innerhalb von 14 Tagen bis sehr große Mengen an hochreinen CD40-B-Zellen (erweiterbar> 10<sup> 9</sup> Zellen pro Patient) von gesunden Spendern sowie Krebs-Patienten<sup> 1-4</sup>. CD40-B-Zellen exprimieren wichtige Lymphknoten homing-Molekülen und können T-Zellen zu gewinnen<em> In-vitro-</em<sup> 5</sup>. Darüber hinaus sie effizient aufnehmen, verarbeiten und präsentieren Antigene an T-Zellen<sup> 6,7</sup>. CD40-B-Zellen wurden nicht nur prime naiv dargestellt, sondern auch zu erweitern Memory T-Zellen<sup> 8,9</sup>. Deshalb CD40-aktivierten B-Zellen (CD40-B-Zellen) wurden als eine alternative Quelle untersucht immunstimulierende Antigen-präsentierende Zellen (APC) für zellbasierte immunotherapy1, 5,10. Zur weiteren Untersuchung, ob CD40-B-Zellen effektiv T-Zell-Antworten induziert in vivo und den zugrunde liegenden Mechanismus haben wir eine Zellkultur-System für die Erzeugung von Maus-CD40-aktivierten B-Zellen zu studieren. Mit Splenozyten gereinigt oder B-Zellen aus C57BL / 6 Mäuse für CD40-Aktivierung wurden optimale Bedingungen wie folgt gekennzeichnet: Ausgehend von Splenozyten von C57BL / 6 Mäuse (Haplotyp H-2b) Lymphozyten sind durch Dichtegradientenzentrifugation und co-kultiviert mit HeLa gereinigt Zellen, die rekombinante murine CD40-Ligand (tmuCD40L HeLa)<sup> 11</sup>. Die Zellen werden rekultiviert alle 3-4 Tage und Schlüsselkomponenten wie CD40L, Interleukin-4,-Mercaptoethanol und Cyclosporin A werden wieder aufgefüllt. In diesem Protokoll haben wir demonstrieren, wie voll aktiviert murine CD40-B-Zellen (mCD40B) mit ähnlichen APC-Phänotyp für die menschliche CD40-B-Zellen (Abb. 1a, b) zu erhalten. CD40-Stimulation führt zu einer raschen Folge und Erweiterung von hochreinem (> 90%) CD19 + B-Zellen innerhalb von 14 Tagen Zellkultur (Abb. 1c, d). Zur Vermeidung von Kontaminationen mit nicht-transfizierten Zellen, ist Ausdruck des murinen CD40-Liganden auf die Transfektanten regelmäßig kontrolliert werden (Abb. 2). Murine CD40-aktivierte B-Zellen können verwendet werden, um B-Zell-Aktivierung und Differenzierung sowie Studien, um ihr Potenzial zu untersuchen Funktion als APC in vitro und in vivo werden. Darüber hinaus stellen sie ein vielversprechendes Werkzeug für den Aufbau therapeutische oder präventive Impfung gegen Tumoren und wird dazu beitragen, Fragen zur Sicherheit und Immunogenität dieses Ansatzes Antwort<sup> 12</sup>.
Protocol
Discussion
Änderungen dieses Protokolls sind möglich, insbesondere über die Herkunft der CD40-Stimulus und die Art der Maus-Stamm verwendet, auch Nachgeben in effiziente Erzeugung von Maus-CD40-aktivierten B-Zellen. Ahmadi et al. haben gezeigt, ähnliche Ergebnisse für Maus-Fibroblasten mit murinen CD40-Ligand transfiziert. In diesem Zusammenhang Präsentation der Xeno-Antigen kann mit Sicherheit ausgeschlossen werden, aber intensive Studien hinsichtlich Sicherheit und Toxizität in vivo gab keine Anzeichen für eine …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Dr. Clemens Wendtner für die Bereitstellung tmuCD40-Ligand-HeLa-Zelllinie.
Materials
A. Preparation of Media:
| Feeder cell wild type medium | Feeder cell selection medium | ||
| Reagent | Concentration | Reagent | Concentration |
| RPMI 1640 | RPMI 1640 | ||
| L-Glutamine | 300 μg/mL | L-Glutamine | 300 μg/mL |
| FBS | 10 % | FBS | 10 % |
| HEPES | 10 mM | HEPES | 10 mM |
| Gentamycin | 15 μg/mL | Gentamycin | 15 μg/mL |
| Hygromycin B | 0.2 mg/mL |
| mCD40-B washing medium | mCD40-B culture medium | ||
| Reagent | Concentration | Reagent | Concentration |
| D-MEM | |
D-MEM | |
| L-Glutamine | 580 μg/mL | L-Glutamine | 580 μg/mL |
| Glucose | 4.5 mg/mL | Glucose | 4.5 mg/mL |
| HEPES | 10 mM | HEPES | 10 mM |
| Gentamycin | 15 μg/mL | Gentamycin | 15 μg/mL |
| MEM | 0.1mM (1x) | ||
| FBS | 10% |
B. Miscellaneous Reagents:
| Reagent | Company | Order No |
| RPMI 1640 | Invitrogen Gibco® | REF 21875 |
| D-MEM | Invitrogen Gibco® | REF 41965 |
| Dulbecco´s PBS (10x) | PAA | Cat No H15-011 |
| Gencin® | Delta Select | Art No 7395800 |
| FBS | LONZA | Cat No DE14-802C |
| HEPES Buffer | PAA | Cat No S11-001 |
| MEM NEAA | Invitrogen Gibco® | REF 11140 |
| Hygromycin B | PAA | Cat No P02-015 |
| Recombinant Murine Interleukin-4 | Immunotools | Cat No 12340045 |
| Cyclosporin A | Novartis | Cat No NDC 0078-0109-01 |
| Trypsin/EDTA (10x) | Invitrogen Gibco® | REF 15400-054 |
C. Miscellaneous Supplies:
| Reagent | Company | Order No |
| Sterile pipette tips | Sarstedt | |
| 6-well plate | NUNC | Cat No 140675 |
| 50mL conical tube | BD Falcon™ | Cat No 352070 |
| Tissue culture flask | Sarstedt | Cat No 83.1813.002 |
Referencias
- Schultze, J. L. CD40-activated human B cells: an alternative source of highly efficient antigen presenting cells to generate autologous antigen-specific T cells for adoptive immunotherapy. J Clin Invest. 100 (11), 2757-2765 (1997).
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- Lapointe, R., Bellemare-Pelletier, A., Housseau, F., Thibodeau, J., Hwu, P. CD40-stimulated B lymphocytes pulsed with tumor antigens are effective antigen-presenting cells that can generate specific T cells. Cancer Res. 63 (11), 2836-2843 (2003).
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- Bergwelt-Baildon, M. S. v. o. n. Human primary and memory cytotoxic T lymphocyte responses are efficiently induced by means of CD40-activated B cells as antigen-presenting cells: potential for clinical application. Blood. 99 (9), 3319-3325 (2002).
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