Yetişkin grubuyla Memeli Nöronlar içine DNA intranükleer Mikroenjeksiyon
Summary
CDNA Doğrudan intranükleer enjeksiyonu, etkili bir post-mitotik hücrelerin transfeksiyon tekniktir. Bu yöntem, tek veya birden fazla cDNA yapıları heterolog protein ekspresyonu yüksek düzeyde sağlar ve tek bir hücre deneyleri çeşitli fizyolojik ilgili bir ortamda incelenmesi gereken protein fonksiyonu sağlar.
Abstract
Primer nöronal hücre kültürleri ölümsüzleştirdi hücre hatları ile karşılaştırıldığında daha fazla biyolojik ilgili sistem temsil ettiği protein fonksiyonu çalışma için değerli araçlar. Ancak, birincil nöronların post-mitotik doğa, elektroporasyon veya kimyasal aracılı transfeksiyon gibi ortak prosedürlerini kullanarak etkili heterolog protein ekspresyonunu engeller. Böylece, diğer tekniklerin etkili olmayan bu bölünen hücreleri proteinleri ifade etmek için istihdam edilmesi gerekmektedir.
Bu makalede, ayrışmış yetişkin sempatik nöronlar cDNA yapıları intranükleer enjeksiyonları gerçekleştirmek için gerekli adımları açıklar. Bu teknik, farklı tipte nöron uygulanmıştır başarıyla heterolog protein ekspresyonu neden olabilir. Mikroenjeksiyon işlemi için gerekli ekipman, hücreleri, N 2 (g) basınç dağıtım sistemi bağlı cDNA çözümü ile dolu bir cam enjeksiyon pipetlemeyin ve mikromanipülatör görselleştirmek için ters bir mikroskop içerir . Mikromanipülatör basınçlı N 2 pipetlemeyin ucundan cDNA çözüm çıkarmak için kısa bir darbe ile mikroenjeksiyon pipetlemeyin enjeksiyon hareketi koordine eder.
Bu teknik, diğer birçok transfeksiyon yöntemleri ile ilişkili toksisite ve tutarlı bir oranı ifade edilmesi, birden fazla DNA yapıları sağlar değildir. Enjekte edilen hücrelerin sayısının düşük olması gibi elektrofizyolojik kayıtlar ve optik görüntüleme gibi tek bir hücre çalışmaları için uygun mikroenjeksiyon işlemi yapar, ancak hücreleri ve yüksek transfeksiyon verimliliği daha çok sayıda gerektiren biyokimyasal deneyleri için ideal olmayabilir. Intranükleer microinjections ekipman ve zaman bir yatırım gerektirmesine rağmen, yeteneği fizyolojik ilgili çevre heterolog protein ekspresyonu yüksek düzeylerine ulaşmak amacıyla bu tekniğin proteinin fonksiyonunu araştırmak için çok yararlı bir araç yapar.
Protocol
Discussion
Karşılaşılan ortak sorunları ve önerileri:
Daha önce belirtildiği gibi, başarılı bir nükleer enjeksiyonlar doku kültürü plakaları yapışık hücrelere sahip bağlıdır. Enjeksiyon başlangıç ertelemek hücre disosiasyon prosedürü izleyerek bir kaç saat nöronlar yemekleri alt yapışmasına yol açar. Buna ek olarak, 0.1 mg / ml 'lik yüksek molekül ağırlıklı poli-L-lisin (Sigma, St Louis, MO) yemekleri alt yüzeye nöronların yardımcıları yapışma kaplama yemekler.
Yüksek konsantrasyonda DNA enjekte etmeye çalışırken özellikle mikroenjeksiyon pipetleri tıkanması, sık görülen bir sorun olabilir. Plazmid DNA izole etmek ve arındırmak için yüksek kaliteli ayırma kolonları kullanarak ve (spin filtreler, hematokrit tüpler iplik) belirtilen ek saflaştırma adımları gerçekleştirmeden önce enjekte parçacık kaldırmak için yardımcı olabilir. Enjeksiyonlar sırasında, basınç enjektör "temiz" fonksiyonu (0.2 s için yeterli) olabilir, ancak bu sorunu çözmezse, yeni bir enjeksiyon pipetlemeyin kullanılmalıdır. Mikroenjeksiyon pipetleri çoğunluğu bir enjeksiyon oturumu sırasında tıkanmış hale gelirse, daha büyük bir açılış ile mikroenjeksiyon pipetlemeyin ipuçları üretmek için damlalıklı cam çektirmenin ayarlarını değiştirerek düşünün.
Nükleer enjeksiyonlar sırasında ortaya çıkan diğer bir konu, doku kültürü yemekleri alt yüzeyi eşitsizliği. Bu değişkenliği doğrudan derinlik beri enjeksiyonlar sırasında pipetlemeyin traversler sabit çekirdeğine enjeksiyon pipetlemeyin ipuçları hedefleme doğruluğunu etkiler. Bu nedenle, bu z-ekseni sınırı, aynı tabak içinde enjeksiyonların seyri sırasında ayarlanması gerekir. Bir ayarlama gerekli olduğunda belirgin olacaktır: (nükleer enjeksiyon (çekirdeği veya hücre tamamen cevapsız hiçbir beyaz tüy) dair hiçbir işaret yok, ya da enjeksiyon pipetlemeyin ucu çanak alt gelir hücre sıkıştırarak hatta) pipetlemeyin ucu çanağın dibine çöküyor. Cam klonlama silindir (OD 10 mm, Kedi No 2.090-01.010, Bellco Cam, Vineland, NJ) nöronların kaplama sırasında daha küçük, daha dar bir alanda onları kısıtlamak için kullanılan olabilir, bu nedenle hareket ettirmek için gerekli mesafeyi en aza indirmek enjeksiyonlar arasındaki enjeksiyon pipetlemeyin. Bu klonlama silindir microinjections performans önce kaldırılır.
Teknik Dezavantajları:
Intranükleer microinjections teknik sabır ve yüksek derecede bir operatör tarafından el becerisi gerektiren talep ediyorlar. Bu tekniği ile Yeterlik, başka bir beceri ile gibi, uygulama ile geliyor. Bu nedenle, gerçek deneyler denemeden önce muhabiri genin tek başına nükleer enjeksiyon uygulama tavsiye edilir. Daha fazla enjeksiyon işlemi yardımcı olmak için, bir bilgisayar programı ve basıncı enjektör içine mikromanipülatör adımları sağlamlaştırmak için mümkün olabilir. Igor Pro (WaveMetrics, Lake Oswego, OR) gibi programlar (mikroenjeksiyon ayarları saklamak için 6,7,8 görmek ve yarı otomatikleştirmek enjeksiyon işlemi için programı çok fonksiyonlu denetleyicileri (ShuttlePro, Çevre Tasarım, Windham, NH) kullanılmalıdır. bakın).
Intranükleer mikroenjeksiyon tekniği Bir diğer dezavantajı ise düşük başarı oranı. Teşebbüs nükleer enjeksiyonlar yaklaşık% 10-20 protein ifade neden olur. Bu etkinliği çok sayıda ifade hücreler, örneğin elektrofizyoloji, çeşitli biyokimyasal testleri için bu yeterli olmayabilir gerekmez uygulamaları için yeterli olabilir rağmen.
Teknik Uygulamalar:
Sakıncaları olmasına rağmen, DNA intranükleer mikroenjeksiyon heterologously nöronların proteinleri ifade etmek için son derece yararlı bir tekniktir.
Yüksek düzeyde protein ekspresyonu, çünkü çekirdeğin enjeksiyonları, düzenleyen bir gen transkripsiyonu ve çekirdeğinde bulunan plazmid uzun istikrar son derece aktif CMV organizatörü sırasında salınan plazmid çok sayıda nükleer microinjections ile elde edilir. Protein-ifadesi üzerine heterolog proteinlerin yüksek düzeyde endojen protein istila etmek için gerekli olan dominant-negatif deneylerde özellikle yararlıdır. Intranükleer enjeksiyonları diğer bir avantajı çok yapıları enjekte edilir çekirdeğine cDNA yapıları tutarlı bir kısmı teslim yeteneğidir. Diğer transfeksiyon yöntemleri ile, her DNA aynı oranda tekrarlanabilir aynı çanağı içinde ve transfections arasında farklı hücrelerin içine inşa tanıtmak için zordur. Çekirdeğin içine cDNA çözüm Direkt enjeksiyonlu değişkenlik bu kaynağı ortadan kaldırır ve ifade proteinlerin oranının etkin bir şekilde titre olanak sağlar.
Geleneksel transfeksiyon yöntemleri post-mitotik hücrelerin içine DNA transfeksiyon REAG ile ilişkili 9 çekirdeği ve kimyasal toksisitesi düşük esas nedeniyle sınırlı etkinliğiveliler 10. Nükleer microinjections çekirdeğindeki genetik materyalin içine mekanik getirerek bu sorunların üstesinden gelmek. Bu tekniği daha fazla dahil olmasına rağmen, fonksiyonel bir biyolojik sistem bir proteinin etkisini araştırmak için yeteneği, bu tekniğin zahmetli doğa dengeler daha fazla endojen sinyal yolları tamamlamak.
Tüm hayvanlar üzerinde deney prosedürleri göre, Ulusal Sağlık Hayvan Bakım ve Kullanım Kuralları Enstitüleri ile yapıldı.
Acknowledgements
Bizim laboratuar araştırmaları NIH İntramural Araştırma Programı, Ulusal Alkol İstismarı ve Alkolizm Enstitüsü tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Ultrafree-MC Filter Unit | Millipore | UFC30VV00 | Durapore PVDF filter; 0.1 μm pore-size | |
| TE buffer | Quality Biological, Inc | 351-010-131 | 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8.0 | |
| Micro-hematocrit capillary tubes | Fisher Scientific | 22-362-574 | Unheparinized Preparation: Soak in 100% ethanol overnight. Wash thoroughly with deionized water three times and dry bake glass in an oven (95°C). Cut the cleaned hematocrit tubes into 3-4 cm length pieces using a diamond-tipped scriber, and seal one end closed with a flame and forceps to hold the glass. Store in a clean glass beaker and cover to prevent dust build-up. |
|
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5417 R | With a fixed angle or swinging-bucket rotor | |
| Microloader 20 μl pipet tips | Eppendorf | 5242 956.003 | ||
| Microinjection capillary glass | World Precision Instruments | TW120F-4 | Thin-walled with filament, 1.2 mm outer-diameter, 0.9 mm inner-diameter, 100 mm length | |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | With platinum-iridium box filament (part # FB330B) | |
| Nikon Diaphot TMD Inverted Microscope | Nikon | 20x and 40x phase-contrast objective lenses, mounted on a vibration isolation table | ||
| Charge-coupled device (CCD) camera | Cohu Inc. | 6410 | ||
| Video monitor | Sony Corporation | PVM-122 | Black and White, 9” screen | |
| Micromanipulator system | Eppendorf | 5171 | ||
| Microinjection Unit | Eppendorf | FemtoJet Express | ||
| Microinjection controller | Contour Design | S-PROV2 | Programmable multimedia controller | |
| Igor Pro | WaveMetrics | Version 4.05A | Command program to control the microinjection controller written by S. Ikeda |
Referencias
- Eccles, J. C. The action potential of the superior cervical ganglion. J Physiol. 85, 179-206 (1935).
- Ikeda, S. R. Voltage-dependent modulation of N-type calcium channels by G-protein βγ subunits. Nature. 380, 255-258 (1996).
- Schofield, G. G., Ikeda, S. R. Potassium currents of acutely isolated adult rat superior cervical ganglion neurons. Brain Res. 485, 205-214 (1989).
- Schofield, G. G., Ikeda, S. R. Sodium and calcium currents of acutely isolated adult rat superior cervical ganglion neurons. Pflugers Arch. 411, 481-490 (1988).
- Dean, D. A., Goldman, R. D., Spector, D. L. Chapter 4. Live Cell Imaging: a Laboratory Manual. 1, 51-66 (2005).
- Ikeda, S. R. Heterologous expression of receptors and signaling proteins in adult mammalian sympathetic neurons by microinjection. Methods Mol Biol. 83, 191-202 (1997).
- Ikeda, S. R. Expression of G-protein signaling components in adult mammalian neurons by microinjection. Methods Mol Biol. 259, 167-181 (2004).
- Ikeda, S. R., Jeong, S. W. Use of RGS-insensitive Gα subunits to study endogenous RGS protein action on G-protein modulation of N-type calcium channels in sympathetic neurons.. Methods Enzymol. 389, 170-189 (2004).
- Washbourne, P., McAllister, A. K. Techniques for gene transfer into neurons. Curr Opin Neurobiol. 12, 566-573 (2002).
- Zhang, Y., Yu, L. C. Single-cell microinjection technology in cell biology. Bioessays. 30, 606-610 (2008).
- Vivaudou, M. Probing the G-protein regulation of GIRK1 and GIRK4, the two subunits of the KACh channel, using functional homomeric mutants. J Biol Chem. 272, 31553-31560 (1997).
