Intranucleares microinjeção de DNA em Dissociated neurônios de mamíferos adultos

I. Preparação para a injecção Esta seção descreve as etapas de preparação que precisam ser tomadas antes da injeção de cDNA para o núcleo dos neurônios. O procedimento de isolamento para os neurônios está além do escopo deste artigo, mas é importante ter neurônios dissociados em células individuais e aderir bem à superfície inferior de 35 mm pratos de cultura de células (veja a discussão para dicas úteis para conseguir isso). Embora uma variedade de diferentes neurônios podem potencialmente ser usados, gânglios periféricos, como o gânglio cervical superior (GCS), ou os gânglios da raiz dorsal são os preferidos para dissecção porque são convenientemente acessível e produzir um grande número de neurônios. Vantagens adicionais do uso de neurônios SCG é que eles são uma população relativamente homogênea de células e bem caracterizados 1,2,3,4. A. Preparação de plasmídeo cDNA para injecção Para evitar a contaminação ou degradação do DNA, devem ser usadas luvas durante a preparação. DNA que codifica a proteína de interesse é subclonado em um vetor de expressão adequado de mamíferos, como o PCI (Promega, Madison, WI), sob a regulação do altamente e constitutivamente ativa por citomegalovírus promotor (CMV). Se a proteína não é rotulado, um plasmídeo repórter, EGFP codificação por exemplo (pEGFP-N1, BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA), é co-injetados para confirmar a injeção de sucesso e de expressão. DNA é isolado usando uma coluna de separação de alta qualidade (por exemplo, QIAfilter Midi-prep kit, Qiagen, Chatsworth, CA) e mais purificada usando uma unidade centrífuga de filtro com um filtro de PVDF (0,1 mícron, Millipore, Bedford, MA) para remover partículas no preparação plasmídeo, que podem obstruir pipetas de injeção durante o processo de injeção. Plasmídeos são armazenadas a -20 ° C em uma concentração de aproximadamente 1 mg / mL em tampão apropriado DNA de armazenamento (por exemplo, tampão TE: 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0). Imediatamente antes da microinjeção, cDNAs plasmídeo são diluídos e misturados à concentração final desejada em tampão TE ou 2 H O. Tipicamente, 5-10 ng / mL do gene repórter é suficiente para rotular células injetadas, ea concentração total de cDNA a ser injetado não deve exceder 200 ng / mL desde DNA é viscoso em altas concentrações e pode obstruir pipetas de injeção. Um pequeno volume de cDNA injectável (mL 5-10) é preparado por mistura gotas de solução sobre a superfície limpa de um pequeno pedaço de Parafilm (lado debaixo do suporte em papel). Misture as gotas de solução em conjunto por pipetagem cima e para baixo várias vezes com um pipetor e evitar a introdução de bolhas de ar durante a mistura. Usando a ponta da pipeta microloader (Eppendorf, Brinkmann Instruments, Westbury, NY), transferir a solução para um tubo de cDNA hematócrito especialmente preparado (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA). Consulte a secção de materiais para obter instruções sobre como preparar tubos de hematócrito (Tabela de Materiais). Coloque o tubo de hematócrito contendo solução injectável cDNA em um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Centrifugar o tubo por 15-30 min a 10 000 g em microcentrífuga equipado com um rotor balde de ângulo fixo ou oscilante (Eppendorf), em temperatura ambiente (20-24 ° C) a partículas de sedimento na solução de cDNA que possam bloquear a microinjeção pipeta. A solução injectável cDNA pode ser mantido em temperatura ambiente durante a sessão de injeção. B. Fabricação de injeção de pipetas Pipetas de vidro descartáveis ​​microinjeção estão comercialmente disponíveis (Femtotips por exemplo, Eppendorf), que são convenientes, mas caro (US $ 10 por pipeta de microinjeção). Pipetas de injeção podem ser fabricados em laboratório, utilizando um P-97 programáveis ​​extrator pipeta Flaming Brown (Sutter Instrument Company, Novato, CA) e filamentosas, de paredes finas tubos de vidro de borosilicato capilar (Instrumentos de Precisão Mundial, Sarasota, FL). Esta opção é mais rentável e permite o controle de forma microinjeção pipeta e tamanho. Um programa de dois estágios é usado para puxar pontas de pipeta estreita microinjeção. Desde a abertura do pipetas de microinjeção é demasiado estreita para examinar sob um microscópio de luz, a qualidade de pipetas de injeção tem que ser avaliada diretamente pela injeção de algumas células antes de as configurações do programa são finalizadas. A seguir estão as configurações aproximado para ajustes do calor, puxe, velocidade e tempo: (pull 1) 600, 115, 15, 250; (pull 2) 640, 130, 65, 200. Essas configurações variam de acordo com diferentes lotes de vidro e pela condição do filamento de aquecimento no extrator, e deve ser ajustado conforme a necessidade. Para mais detalhes veja 5. Puxe várias pipetas (2-5) de injeção por prato de neurônios a ser injetado, em caso de danos ou problemas durante a sessão de injeção. Pipetas de injeção armazenar em um recipiente coberto para evitar a entrada de poeira a ponta da pipeta de microinjeção. II. Microinjeção intranucleares tenda "> Esta seção detalha o processo de injeção de cDNA para o núcleo dos neurônios. microinjeção A configuração básica inclui um microscópio de contraste de fase invertido (eg Nikon DTM Diaphot, Nikon, Melville, NY) para visualizar o processo, micromanipulador (eg Eppendorf 5171) para controlar o movimento da pipeta de injeção e uma pressão de injeção (por exemplo, Eppendorf FemtoJet Express) para expulsar a solução cDNA da pipeta. Conectando a pressão injector ao micromanipulador permite a sincronização dos dois últimos processos durante as injeções. Outros opcional, mas altamente recomendado, componentes incluem um sistema de monitoramento montada de vídeo (câmera CCD, Cohu Inc., San Diego, CA, preto e branco para monitores de vídeo, a Sony Corporation, Tóquio, Japão). Este sistema não é um requisito absoluto para injectáveis; No entanto, o monitor preto e branco oferece alto contraste para melhor visualização do núcleo da célula e oferece uma experiência de visualização mais confortável durante longas sessões de injecção. Além disso, um computador portátil que executa o software para operar um controlador de mão pode ser utilizada para semi- automatizar o processo de injecção (ver discussão para detalhes). O tempo ideal para injetar neurônios SCG é de 3-6 horas pós-dissociação. Nesta fase, as células são esféricas, fortemente ligado ao fundo do prato, eo núcleo é claramente visível, sob um microscópio de contraste de fase, como uma central rodada organela com uma membrana escura, contendo uma nucléolos únicos ou múltiplos (Figura 1A). Coloque um prato de neurônios dissociados no centro do palco microscópio. Ajustar o foco e otimizar a ótica de contraste de fase do microscópio para os núcleos de neurônios são claramente visíveis. Pipete 2 de solução de cDNA preparado em uma pipeta de microinjeção usando uma ponta da pipeta microloader. Evitar a elaboração de solução perto do fundo do tubo de hematócrito pois isso pode atiçar partículas que se instalaram durante a centrifugação. O filamento da microinjeção pipetas devem ajudar na elaboração solução para a ponta, mas se pequenas bolhas de ar persistirem, suavemente dê pequenos toques do lado do vidro para desalojá-los. Inserir a pipeta de microinjeção no suporte da pressão capilar injector e depois segura o titular ao micromanipulador. O titular é fixada em um ângulo de 45 °. Abaixe a pipeta de microinjeção no prato. Como a pipeta entra no meio de cultura, um menisco é formado que afeta a refração da luz e reduz a qualidade da imagem dos neurônios. Para aliviar este problema, a torre do anel de fase pode ser levemente deslocada até os núcleos de neurônios são claramente visíveis novamente. Alguns sistemas de injeção de pressão têm uma função "clean", que aplica uma pressão de ar máxima da ponta da pipeta de microinjeção de curta duração. Use esta função para limpar a pipeta de detritos antes do início e durante as injeções se a ponta aparece entupidos. Se o líquido dissipado não é visível na tela ao mesmo tempo utilizando esta função, substitua com uma pipeta nova injecção. Centro de pipeta a microinjeção no monitor de visualização e alinhe a ponta ao lado de um neurônio e no mesmo plano focal como o nucléolo. Defina esta posição como o limite inferior do eixo z na micromanipulador. Esta posição é a profundidade da pipeta de microinjeção vai avançar para durante as injeções. Agora a posição da ponta de aproximadamente 30 mm acima deste ponto para que a microinjeção pipeta limpa o top dos neurônios. O "injetar" modo de um micromanipulador Eppendorf 5171 pode ser definido com as seguintes configurações para realizar injeções intranuclear. A função é definida em injetar, enquanto a função é empalar parou. Um caminho de injeção diagonal (ao longo do x e eixo z) produz o mínimo de danos às células e, portanto, o modo axial deve ser usado para injeções. Uma velocidade de injeção de 300 mm / s é suficiente, e sincronizar acúmulo de pressão quando a pipeta de microinjeção atinge o conjunto de eixo z limite. A pressão de injeção controla a quantidade de solução cDNA injetada no núcleo. No modo de injeção "automático", a entrega de DNA é controlada por tempo e iniciado pelo micromanipulador conectado. A pressão de injeção (Pi) deve ser definido entre 100 a 200 hectopascais (hPa; 1 hPa ~ 0,015 psi); altas pressões de injeção não melhorar as taxas de sucesso ou qualidade de injeções e podem indicar outros problemas com o tamanho da ponta da pipeta de microinjeção de DNA ou pureza . Uma duração de injeção (TI) de 0,3 s e uma pressão de compensação (Pc), de 30 hPa, que fornece uma pressão positiva constante para evitar a entrada de oclusão partículas do meio de cultura para a ponta da pipeta, deve ser usado. Posição do neurônio para ser injetado sob a ponta da pipeta de microinjeção usando o controle do microscópio estágio xy eixo. Alinhe a ponta da pipeta acima do centro do núcleo, concentrando-se para trás e para frente entre tele a ponta e os nucléolos. Injetar o núcleo, pressionando o botão injetar (no micromanipulador). Para a etapa de injeção, o movimento da pipeta de microinjeção e da libertação de solução de cDNA são controlados pelo micromanipulador. É difícil confirmar sucesso injeções intranuclear por olho, mas a injeção da solução de viscosidade relativamente baixa cDNA (em comparação com o ambiente viscoso nuclear), muitas vezes aparece como uma pluma branca sob a óptica de contraste de fase e pode ser usado como um indicador da injeção para o núcleo. Às vezes, a pipeta de microinjeção não penetrar a membrana nuclear e simplesmente cutuca o núcleo. Uma tentativa segunda injeção na mesma posição pode levar a uma injeção bem-sucedida de DNA no núcleo. Inchaço da célula é normalmente indicativo de injeção citoplasmática não intencional. Além disso, o inchaço nuclear significativo não é bem tolerado pelos neurônios e geralmente resulta em morte celular logo depois, assim, a pressão de injeção e duração não deve exceder os valores sugeridos. Continue injetando neurônios reposicionando o estágio do microscópio para alinhar o neurônio seguinte de acordo com a pipeta de microinjeção. Sistematicamente navegar através do prato para injetar cerca de 5-10 núcleos antes de devolver o prato de neurônios para a incubadora para a incubação durante a noite. Neurônios injetou com sucesso podem ser identificados no dia seguinte pela expressão do gene repórter. III. Resultados representante Figura 1: Superior gânglio cervical (SCG) neurônios. Imagem de contraste de fase da SCG neurônios três horas pós-dissociação (A). Nesta fase, o núcleo é claramente visível que auxilia o alinhamento da ponta da pipeta de microinjeção. O núcleo aparece no centro de neurônios com um único (à esquerda) ou múltiplos nucléolos (direita) escura. SCG neurônios 16 horas após a injeção de EGFP cDNA para o núcleo (B). Esquerda, SCG neurônios visto sob iluminação de contraste de fase. Direito, a imagem de epifluorescência dos neurônios mesmo mostrando injeção bem sucedido e resultando expressão EGFP em um neurônio. Branco barra de escala é de 20 mM. Figura 2: Whole-cell gravações de correntes através heterologously-expressa proteína G acoplada internamente retificar K + (GIRK) canais de SCG neurônios. GIRK correntes (I GIRK) foram evocados por uma rampa de tensão 200 ms de -140 a +40 mV a partir de um potencial de realização de -60 mV (inset de A) ativação seguintes endógenos α 2-adrenérgicos por norepinefrina (NE, 10 mM) . Traços sobrepostos são gravações a partir do mesmo neurônio e indicar, antes (preto) e após a aplicação de qualquer NE sozinho (azul) ou NE, acrescido de 10 mM Ba 2 + (vermelho). Linhas tracejadas indicam o nível zero de corrente. Para gravar eu GIRK, a solução externa contida (em mM) 130 NaCl, 5,4 KCl, 10 HEPES, 10 CaCl 2, 0,8 MgCl 2, 15 de glicose, 15, sacarose e 0,0003 TTX, pH ajustado para 7,4 com NaOH. A solução de gravação interna contida (em mM) 135 KCl, 11 EGTA, um CaCl 2, MgCl 2 2, 10 HEPES, 4 MgATP, e 0,3 Na 2 GTP, ajustada para pH 7,2 com KOH. A falta de corrente provocada pela rampa de tensão na presença do NE em neurônios uninjected SCG (A) demonstra que os neurônios SCG não expressam canais GIRK endógena. Injeção de sucesso de codificação cDNA plasmídeo funcional GIRK canal 11 dá origem a grandes correntes durante a rampa de tensão quando expostos à NE (B, esquerda). Correntes têm as características típicas das correntes através de canais GIRK: ativação por um agonista do receptor acoplado à proteína G (NE), retificação para dentro, e bloco de correntes pelo bloqueador putativa GIRK canal, Ba 2 + (B, traço vermelho à direita). Círculos abertos e cheios representam Eu GIRK na exploração e corrente de pico, respectivamente. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada da figura 2.