Microinjection Intranuclear של דנ"א לתוך ניתק נוירונים היונקים למבוגרים
Summary
הזרקה ישירה של intranuclear cDNA היא טכניקה יעילה transfection שלאחר mitotic תאים. שיטה זו מספקת רמות גבוהות של ביטוי חלבון מן Heterologous בונה cDNA בודדות או מרובות ומאפשר תפקוד החלבון להיחקר בסביבה רלוונטית מבחינה פיזיולוגית עם מגוון רחב של מבחני תא בודד.
Abstract
ראשי בתרביות תאים עצביים הם כלי רב ערך כדי ללמוד לתפקד חלבון כיוון שהם מייצגים מערכת יותר רלוונטי מבחינה ביולוגית לעומת שורות תאים הונצח. עם זאת, טבע פוסט mitotic של נוירונים העיקרי מונע חלבון יעיל הביטוי Heterologous באמצעות הליכים נפוצים כגון electroporation או כימית בתיווך transfection. לפיכך, טכניקות אחרות חייב להיות מועסק על מנת לבטא בצורה יעילה החלבונים האלה בתאים שאינם מתחלקים.
במאמר זה נתאר את הצעדים הנדרשים לביצוע זריקות intranuclear של מבנים cDNA לתוך ניתק נוירונים אוהד מבוגר. טכניקה זו, אשר הוחל על סוגים שונים של נוירונים, מצליח לגרום ביטוי חלבון Heterologous. ציוד חיוני עבור ההליך microinjection כוללת מיקרוסקופ הפוך לדמיין תאים, זריקת כוס pipet מלאים פתרון cDNA המחובר מערכת N 2 (g) משלוח לחץ, micromanipulator. Micromanipulator מרכזת את ההצעה הזרקת pipet microinjection עם הדופק קצרה של N 2 בלחץ להוציא cDNA פתרון מקצה pipet.
טכניקה זו אין רעילות הקשורות הרבה שיטות transfection אחרים ומאפשר בונה DNA מרובים להתבטא ביחס עקבי. מספר נמוך של תאים מוזרק הופכת את ההליך microinjection גם מתאים מחקרים תא בודד כגון הקלטות הדמיה אלקטרו אופטית, אבל לא יכול להיות אידיאלי עבור מבחני ביוכימיים הדורשים מספר גדול יותר של תאים transfection יעילות גבוהה יותר. למרות microinjections intranuclear דורשים השקעה של ציוד הזמן, את היכולת להשיג רמות גבוהות של ביטוי חלבון Heterologous בסביבה רלוונטית מבחינה פיזיולוגית עושה את הטכניקה הזאת כלי שימושי מאוד לחקור את תפקוד החלבון.
Protocol
Discussion
בעיות נפוצות נתקל והצעות:
כפי שהוזכר קודם לכן, זריקות גרעיני מוצלח תלוי שיש תאים חסיד אל צלחות בתרבית רקמה. דחיית תחילת זריקות כמה שעות לאחר הליך תא דיסוציאציה מאפשר נוירונים לדבוק בתחתית הכלים. בנוסף, מנות עם ציפוי 0.1 מ"ג / מ"ל של משקל מולקולרי גבוה פולי-L-ליזין (Sigma, סנט לואיס, מיזורי) עזרי הידבקות של נוירונים על פני השטח התחתון של הכלים.
חסימה של pipets microinjection, במיוחד כאשר מנסים להזריק ריכוז גבוה של ה-DNA, יכולה להיות בעיה תכופים. באמצעות הפרדה גבוהה עמודות איכות לבודד ולטהר פלסמיד דנ"א, ואת ביצוע הפעולות טיהור נוספים שהוזכרו (מסננים ספין, מסתובב צינורות המטוקריט) יכול לעזור להסיר חלקיקים לפני הזרקה. במהלך זריקות, הפונקציה "נקי" של לחץ ההזרקה אפשר להשתמש (עבור s 0.2 מספיק), אבל אם זה לא פותר את הבעיה, pipet הזרקה חדשה יש להשתמש. אם רוב pipets microinjection להיות סתומים במהלך הפגישה זריקה, שקול לשנות את ההגדרות של חולץ pipet זכוכית כדי לייצר pipet טיפים microinjection עם פתח גדול יותר.
סוגיה נוספת שעולה במהלך זריקות גרעיני הוא חוסר האחידות של פני השטח התחתון של מנות בתרבית רקמה. השתנות זו משפיע ישירות על דיוק המיקוד של טיפים pipet זריקה לגרעין מאז עומק שחוצה pipet במהלך זריקות קבוע. לכן, להגביל את זה Z-ציר חייב להיות מותאם במהלך זריקות בתוך צלחת אחת. זה יהיה ברור כאשר התאמה הכרחית: לא תהיה אינדיקציה הזרקת גרעיני (לא נוצה לבנה או בגרעין התא הוא החמיץ לחלוטין), או קצה pipet הזרקת מתקרב לתחתית הקערה (דחיסת התא או אפילו את קצה pipet מתרסק לתוך החלק התחתון של המנה). זכוכית שיבוט צילינדרים (. OD 10 מ"מ, חתול מס '2090-01010, Bellco זכוכית, Vineland, NJ) יכול לשמש במהלך ציפוי של נוירונים להגביל אותם באזור קטן יותר מצומצם יותר, ולכן צמצום המרחק הנדרש כדי להעביר pipet בין הזרקת זריקות. גלילים אלה שיבוט יוסרו לפני ביצוע microinjections.
החסרונות של השיטה:
Microinjections Intranuclear הם תובענית מבחינה טכנית, אשר דורשים סבלנות רמה גבוהה של מיומנות ידנית על ידי המפעיל. בקיאות עם הטכניקה הזו, כמו עם מיומנות אחרת, מגיע עם התרגול. לכן, מומלץ לתרגל זריקות הגרעין של הגן כתב לבד לפני שתנסה ניסויים בפועל. כדי להמשיך ולסייע בתהליך הזרקה, יתכן שניתן יהיה לגבש את הצעדים של micromanipulator והלחץ מזרק לתוך תוכנת מחשב. תוכניות כגון איגור Pro (WaveMetrics, אגם Oswego, OR) יכול להיות מנוצל כדי לשמור הגדרות microinjection ו לתוכנית בקרי רב תכליתיים (ShuttlePro, קונטור עיצוב, ווינדהאם, NH) כדי למחצה להפוך את תהליך ההזרקה (ראה 6,7,8 עבור לפרטים נוספים).
חסרון נוסף של הטכניקה microinjection intranuclear הוא שיעור הצלחה נמוך. כ 10-20% של זריקות גרעיני ניסו להוביל ביטוי חלבון. בעוד יעילות זה עשוי להיות מספיק עבור יישומים שאינם דורשים מספר גדול של תאים לבטא, electrophysiology למשל, עבור מבחני ביוכימיים שונים זה עלול שלא להספיק.
יישומים של הטכניקה:
למרות חסרונות, microinjection intranuclear של ה-DNA הוא טכניקה שימושית מאוד עבור heterologously לבטא חלבונים נוירונים.
רמות גבוהות של ביטוי חלבון מושגות עם microinjections גרעיני בגלל מספר גדול של פלסמידים שוחרר לתוך הגרעין במהלך זריקות, מקדם מאוד פעיל CMV בוויסות שעתוק הגנים, יציבות ארוכה של פלסמידים בגרעין. חלבון על הביטוי הוא שימושי במיוחד דומיננטי שלילי בניסויים שבהם רמות גבוהות של חלבונים Heterologous נדרשים להכריע את חלבון אנדוגני. יתרון נוסף של intranuclear זריקות היא היכולת לספק את חלק עקבית של בונה cDNA לגרעין כאשר בונה מרובים מוזרקים. בעזרת שיטות transfection אחרים, קשה reproducibly להציג שיעור זהה של ה-DNA בכל לבנות לתוך תאים שונים בתוך התבשיל זהה בין transfections. הזרקה ישירה של פתרון cDNA לתוך הגרעין זה מבטל מקור שונות ומאפשר יחס של חלבונים הביע להיות titered ביעילות.
שיטות transfection מסורתית יש יעילות מוגבלת שלאחר mitotic תאים בגלל התאגדות נמוכה של דנ"א לתוך הגרעין 9 רעילות כימית הקשורים reag transfectionלהורים 10. Microinjections גרעיני להתגבר על בעיות אלו על ידי החדרת חומר גנטי מכני לתוך הגרעין. למרות הטכניקה הזו הוא מעורב יותר, את היכולת ללמוד את ההשפעה של חלבון במערכת ביולוגית תפקודית, להשלים עם מסלולי איתות אנדוגני, יותר מפצה על אופיו מייגע של טכניקה זו.
כל הליכי הניסוי על בעלי חיים בוצעו בהתאם המכונים הלאומיים לבריאות של הנחיות לטיפול בבעלי חיים ולשימוש.
Acknowledgements
מחקר במעבדה שלנו היא נתמכת על ידי תוכנית המחקר עירונית של NIH, המכון הלאומי על אלכוהול התעללות ועל אלכוהוליזם.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Ultrafree-MC Filter Unit | Millipore | UFC30VV00 | Durapore PVDF filter; 0.1 μm pore-size | |
| TE buffer | Quality Biological, Inc | 351-010-131 | 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8.0 | |
| Micro-hematocrit capillary tubes | Fisher Scientific | 22-362-574 | Unheparinized Preparation: Soak in 100% ethanol overnight. Wash thoroughly with deionized water three times and dry bake glass in an oven (95°C). Cut the cleaned hematocrit tubes into 3-4 cm length pieces using a diamond-tipped scriber, and seal one end closed with a flame and forceps to hold the glass. Store in a clean glass beaker and cover to prevent dust build-up. |
|
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5417 R | With a fixed angle or swinging-bucket rotor | |
| Microloader 20 μl pipet tips | Eppendorf | 5242 956.003 | ||
| Microinjection capillary glass | World Precision Instruments | TW120F-4 | Thin-walled with filament, 1.2 mm outer-diameter, 0.9 mm inner-diameter, 100 mm length | |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | With platinum-iridium box filament (part # FB330B) | |
| Nikon Diaphot TMD Inverted Microscope | Nikon | 20x and 40x phase-contrast objective lenses, mounted on a vibration isolation table | ||
| Charge-coupled device (CCD) camera | Cohu Inc. | 6410 | ||
| Video monitor | Sony Corporation | PVM-122 | Black and White, 9” screen | |
| Micromanipulator system | Eppendorf | 5171 | ||
| Microinjection Unit | Eppendorf | FemtoJet Express | ||
| Microinjection controller | Contour Design | S-PROV2 | Programmable multimedia controller | |
| Igor Pro | WaveMetrics | Version 4.05A | Command program to control the microinjection controller written by S. Ikeda |
Referencias
- Eccles, J. C. The action potential of the superior cervical ganglion. J Physiol. 85, 179-206 (1935).
- Ikeda, S. R. Voltage-dependent modulation of N-type calcium channels by G-protein βγ subunits. Nature. 380, 255-258 (1996).
- Schofield, G. G., Ikeda, S. R. Potassium currents of acutely isolated adult rat superior cervical ganglion neurons. Brain Res. 485, 205-214 (1989).
- Schofield, G. G., Ikeda, S. R. Sodium and calcium currents of acutely isolated adult rat superior cervical ganglion neurons. Pflugers Arch. 411, 481-490 (1988).
- Dean, D. A., Goldman, R. D., Spector, D. L. Chapter 4. Live Cell Imaging: a Laboratory Manual. 1, 51-66 (2005).
- Ikeda, S. R. Heterologous expression of receptors and signaling proteins in adult mammalian sympathetic neurons by microinjection. Methods Mol Biol. 83, 191-202 (1997).
- Ikeda, S. R. Expression of G-protein signaling components in adult mammalian neurons by microinjection. Methods Mol Biol. 259, 167-181 (2004).
- Ikeda, S. R., Jeong, S. W. Use of RGS-insensitive Gα subunits to study endogenous RGS protein action on G-protein modulation of N-type calcium channels in sympathetic neurons.. Methods Enzymol. 389, 170-189 (2004).
- Washbourne, P., McAllister, A. K. Techniques for gene transfer into neurons. Curr Opin Neurobiol. 12, 566-573 (2002).
- Zhang, Y., Yu, L. C. Single-cell microinjection technology in cell biology. Bioessays. 30, 606-610 (2008).
- Vivaudou, M. Probing the G-protein regulation of GIRK1 and GIRK4, the two subunits of the KACh channel, using functional homomeric mutants. J Biol Chem. 272, 31553-31560 (1997).
