Primer Capture Estensione: Recupero sequenza mirata da fonti DNA fortemente degradate

Questo metodo è stato utilizzato nella ricerca riportata in Briggs et al. Science 325 (5938). 318-321 (2009) . Reagenti richiesti: AmpliTaq Gold DNA polimerasi 10x GeneAmp PCR Buffer II MgCl2 25mM dNTP mix, 25 mm ciascuno BSA, 10 mg ml-1 in acqua Biologia molecolare acqua di grado EB tampone (fornito con il kit MinElute purificazione PCR), 10 mM Tris HCl, pH 8,5 MinElute PCR Purification Kit M-270 streptavidina Dynabeads 2x Binding e Wash (BW) buffer (2 M di NaCl, 10 mM Tris-Cl, 1 mM EDTA, pH 8.0, 0.2% Tween 20) 1x Binding e Wash (BW) buffer (2x tampone 2X BindWash diluito in acqua) Hot Wash (HW) buffer (2,5 mm MgCl, 1X Taq Oro tampone, 0,1% Tween 20) Per informazioni sul produttore in materia di non-standard reagenti e attrezzature vediamo dopo tavola. 1) Biblioteca di amplificazione Il modello di DNA qui è una libreria di 454 preparata da una fonte a basso numero di copie del DNA, come descritto in (Rohland e Hofreiter, 2007a, 2007b) e (Maricic e Pääbo, 2009). Per amplificare l'intera biblioteca, preparare l'impasto seguenti PCR: Reagente microlitri per reazione Acqua 45 10X Gene Amp PCR tampone II 10 MgCl 2 (25mm) 10 BSA (10 mg / ml) 2 dNTPs (25 mm ciascuno) 1 454 emPCR fwd primer/10uM 3 454 emPCR RVS primer/10uM 3 AmpliTaq Gold DNA polimerasi (5 U / mL) 1 454 DNA stampo biblioteca 25 Totale 100 Utilizza il seguente programma PCR in un Thermo cycler per 14 cicli di amplificazione 95 ° C 12min 95 ° C '30 60 ° C (temperatura di ricottura o desiderato) 1 min 72 ° C 1 min Vai a 2 (x 13) 72 ° C 5min 10 ° C ∞ Purificare la reazione sopra una colonna Qiagen giro MinElute secondo le istruzioni del produttore. Eluire in 50 microlitri di buffer EB. Quantificare il prodotto purificato amplificato e un aliquota della biblioteca non amplificata con qPCR (Meyer et al., 2007). Se il prodotto amplificato ha più di 1 X 10 12 copie per ul, ridurre la quantità di modello nella fase successiva estensione Primer per garantire che non più di 2 x 10 12 copie vengono aggiunti alla reazione di primer extension. 2) Primer Extension Preparare una master mix per il numero di reazioni. Reagente microlitri per reazione Acqua 45 10X Gene Amp PCR tampone II 10 MgCl 2 (25mm) 10 BSA (10 mg / ml) 2 dNTPs (25 mm ciascuno) 1 454 emPCR fwd primer/10uM 3 454 emPCR RVS primer/10uM 3 AmpliTaq Gold DNA polimerasi (5 U / mL) 1 454 DNA stampo biblioteca 25 Totale 100 Eseguire il seguente programma in un termociclatore per la reazione singolo primer extension: 95 ° C 12min 60 ° C (o il vostro PEC fondo ricottura temperatura se diverso) 1 min 72 ° C 5 min 72 ° C per sempre! PUNTO CRITICO Mantenere reazione dopo l'estensione a 72 ° C. Poi direttamente pipetta 150ul PBI o PB tampone per la depurazione QIAGEN MinElute nei tubi prima di togliere dal blocco di calore. Questo è importante per evitare di non-specifico fondo di ricottura e catturare il composto si raffredda. Purificare la reazione sopra una colonna Qiagen giro MinElute, secondo le istruzioni del produttore. Eluire in 50 microlitri EB. 3) estensione Capture prodotto Risospendere soluzione madre di M-270 perle vortexando. Estrarre 25 microlitri sospensione tallone per campione. Lavare due volte con le perline 500ul 2x BW buffer e risospendere in 25 microlitri di buffer 2xBW per campione. Aggiungere 25 microlitri eluato dal passo 2,3-25 microlitri sospensione perle dal punto 3.1. Mescolare poi ruotare per 15 minuti a temperatura ambiente. Raccomandati: tenere restante 5 ul dell'eluato dal punto 2.3 per la quantificazione qPCR. Trasferire il composto tutto in una nuova provetta 1,5 ml (questo aiuta a ridurre il riporto di non bersaglio frammenti biblioteca). Pellet il surnatante con il collettore di particelle magnetiche (MPC) e scartare il surnatante. Lavare 5 volte con 500 microlitri di buffer 1xBW (molti lavaggi aiutano a rimuovere come sfondo il più possibile). Dopo la fase di lavaggio scorso, centrifugare brevemente e rimuovere le ultime tracce di sopranatante. Aggiungere 500μl 1x Hot Wash (HW) buffer. Agitare per 2 minuti a 65 ° C (o 5C sopra il primer PEC Tm) su un blocco termico. Rimuovere il surnatante subito dopo questo, per ridurre al minimo il raffreddamento. (Questo passaggio è quello di rimuovere i frammenti di fondo ancora associato con primer PEC, ma non di fatto esteso durante la fase di estensione). Rimuovere le ultime tracce di sopranatante. Risospendere il pellet tallone in 30 microlitri di buffer EB. Trasferire il composto tutto in una nuova provetta 1,5 ml (questo aiuta a ridurre il riporto di non bersaglio frammenti biblioteca). Incubare a 95 ° C per 3 minuti in un termociclatore per l'eluizione. Posto nella MPC e rimuovere il supernatante, avendo cura di lasciare alle spalle le perline. 4) Acquisizione di amplificazione del prodotto Preparare una master mix PCR per il numero di campioni. Reagente microlitri per reazione Acqua 45 10X Gene Amp PCR tampone II 10 MgCl 2 (25mm) 10 BSA (10 mg / ml) 2 dNTPs (25 mm ciascuno) 1 454 emPCR fwd primer/10uM 3 454 emPCR RVS primer/10uM 3 AmpliTaq Gold DNA polimerasi (5 U / mL) 1 L'acquisizione dei prodotti eluiti 25 Totale 100 Utilizza il seguente programma PCR in un Thermo cycler per 14 cicli di amplificazione: 95 ° C 12min 95 ° C '30 60 ° C (temperatura di ricottura o desiderato) 1 min 72 ° C 1 min Vai a 2 (x 13) 72 ° C 5min 10 ° C ∞ Purificare la reazione sopra una colonna di silice giro Qiagen MinElute secondo le istruzioni del produttore. Eluire in 50 microlitri di buffer EB. Il prodotto può essere ora utilizzato sia per un secondo round di cattura, a partire dal punto 2.1, o inserito direttamente in emulsione 454 Protocollo PCR, per il sequenziamento. Rappresentante dei risultati: E 'fortemente consigliato quando si inizia con il protocollo PEC per effettuare prima una reazione di cattura in cui una piccola quantità di una' sequenza positiva obiettivo di controllo '(ad esempio un ~ 100bp prodotto di PCR – 1 picogrammo è abbastanza facilmente) si mescola con il normale raccomandata quantità di amplificato 454 Template Library (vedi punto 2.1), e la cattura viene eseguita con un primer singolo PEC progettato per catturare il prodotto controllo positivo. Se questa reazione viene eseguito il controllo, qPCR con entrambi positivi di controllo specifico e 454 adattatore specifico per coppie di primer può essere usato per quantificare la quantità di 'obiettivo di controllo' contro di fondo nella reazione fondo purificato estensione (1,3), estensione del prodotto Primer (2,3 ) ed eluita prodotto di acquisizione tallone (3,6). In questo modo, sia l'efficacia della rimozione di fondo ("specificità") e l'efficienza di recupero di destinazione ("sensibilità") nella vostra condizioni sperimentali possono essere misurati direttamente. Un successo PEC protocollo normalmente ha le seguenti caratteristiche – Sensibilità (misurata dalla quantità di target di controllo mantenuto attraverso il protocollo): Importo totale del target di controllo in eluiti prodotto di acquisizione tallone (3,6) = ~ 1-20% del totale in purificato estensione reazione Primer (2,3). Di fondo (misurata da 454 coppia emPCR primer): Importo totale di sfondo in eluita prodotto di acquisizione tallone (3,6) <0,01% del totale in reazione fondo purificato estensione (2,3). Se c'è meno dell'1% del target rimanenti nel prodotto finale, il passo estensione primer può non hanno avuto successo e devono essere esaminati. Se c'è molto di più dello 0,01% del fondo residuo nei prodotti finali, le fasi di lavaggio potrebbe essere stato erroneamente eseguito e deve essere indagato.