التجمع ، والتحميل ، والمحاذاة لخلية نموذج تحليلي نابذة فائقة السرعة
Summary
نابذة فائقة السرعة وتحليلية (AUC) خلية العينة يحمل عينة والعازلة المرجعية وخلال التجارب ، ويتعرضون للفراغ وسرعات عالية تصل إلى الدوار 60000 دورة في الدقيقة. وهذا الفيديو يظهر انتباه دقيق إلى التفاصيل اللازمة لتحميل والتجمع ومواءمة هذا العنصر مهم جدا من تجربة الجامعة الأمريكية بالقاهرة.
Abstract
نابذة فائقة السرعة وتحليلية (AUC) هو أداة قوية تسمح لنا البيوفيزيائية لتسجيل ملامح ترسيب الجزيئات أثناء الطرد المركزي بسرعة عالية. عند تخطيط سليم وتنفيذ ، يمكن لسرعة الترسيب AUC أو الترسيب تجربة التوازن تكشف الكثير عن بروتين في ما يخص حجم وشكل ونقاء العينة ، ومعامل الترسيب ، والتفاعلات الدول oligomerization البروتين البروتين.
هذا الأسلوب ، ومع ذلك ، يتطلب مستوى دقيق من الاهتمام التقني. عينة الخلايا عقد مركز قطعة تقع بين مجالس قطاعية نافذة اثنين. ومختومة أنها ذات ضغط عزم دوران حول 120-140 في / رطل. يتم تحميل المخزن المرجعية والعينة في القطاعات محور ثم بعد الختم ، تتماشى تماما الخلايا في الدوار التيتانيوم بحيث أنظمة الكشف البصري على حد سواء عينة المسح والعازلة الإشارة في خط الوسط من خلال نفس المسار شعاعي محور كل قطاع في حين تناوب بسرعة تصل إلى 60 دورة في الدقيقة 000 ، وتحت فراغ عالية جدا
ليس فقط هو الصحيح التجميع خلية العينة الحرجة ، ومكونات الخلية عينة غالية جدا ويجب العناية بشكل صحيح لضمان أن تكون في حالة صالحة للعمل في المثلى لتجنب تسرب والكسر خلال التجارب. التعامل مع النوافذ بعناية ، حتى لأدنى الكراك أو خدش يمكن أن يؤدي إلى كسر في جهاز الطرد المركزي. يجب أن يكون محور الاتصال بين والنوافذ تكون ضيقة قدر الإمكان ، أي لا ينبغي حلقات نيوتن ق تكون مرئية بعد تطبيق ضغط عزم الدوران. يمكن الغبار ، والوبر ، وخدوش والزيوت على النوافذ أو محور كل حل وسط وهذا الاتصال بسهولة بالغة تؤدي الى تسرب من الحلول من قطاع إلى آخر أو تسرب للخروج من محور جميعا. لا يتم فقدان العينات الثمينة ، وتسرب من الحلول خلال التجربة سوف تسبب خللا في الضغط في الخلية التي غالبا ما يؤدي إلى تحطيم النوافذ والقطع المركزية. بالإضافة إلى ذلك ، يجب أن الجوانات المكونات والمقابس بالسكن ينبغي أن تكون في مكان آمن لتجنب الحلول التي انسحبت من القطاع من خلال الثقوب محور التحميل من فراغ عالية في غرفة الطرد المركزي. يجب أن المتشددين النافذة وحشيات تكون خالية من التشققات وفواصل التي يمكن أن تسبب الحركة مما أدى إلى تحطيم النوافذ.
هذا الفيديو سوف تظهر إجراءاتنا التجمع خلية العينة ، وعزم الدوران والتحميل والمحاذاة الدوار للمساعدة في تقليل ضرر عنصر ، حل تسريب والكسر أثناء التجربة AUC الكمال.
Protocol
Discussion
الجمعية الخلية السليمة ، أو الإدراج العينة ، والمحاذاة خلية في الدوار هو أمر حاسم لجودة عالية التجارب الجامعة الأمريكية بالقاهرة. هذا صحيح ، وعلى وجه الخصوص ، للتجارب التي تتطلب تحليلا مفصلا للغاية من البيانات المطلوبة على ملامح ترسيب الجزيئات ، على سبيل المثال ، عند دراسة التفاعلات البروتين وتحديد المبالغ الإجمالية التتبع. في كثير من الأحيان على جودة الإعداد التجريبية يحد عن دقة ودقة النتائج من دراسة بالجامعة الأمريكية. للاطلاع على تفاصيل عملية تصميم وتنفيذ المزيد من التجارب الجامعة الأمريكية بالقاهرة ، انظر المراجع 1 — 3. ويجري حاليا عقد حلقات عمل تغطي عملية الإعداد ، من الناحية النظرية ، وتحليل البيانات من التجارب AUC مرتين في السنة في مختبرنا في المعاهد الوطنية للصحة [4].
Acknowledgements
نعترف دعم البحوث من قبل برنامج بحوث جماعية من NIBIB ، المعاهد الوطنية للصحة.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 4-place Ti analytical rotor | Beckman Coulter | 361964 | ||
| Torque stand assembly | Beckman Coulter | 361318 | ||
| Cell alignment tool | Beckman Coulter | 362340 | ||
| Spinkote Lubricant | Beckman Coulter | 306812 | ||
| Counterbalance | Beckman Coulter | 360219 | ||
| Cell Housing kit | Beckman Coulter | 334602 | ||
| Window gasket | Beckman Coulter | 327021 | ||
| Window liner | Beckman Coulter | 362329 | ||
| Window, sapphire | Beckman Coulter | 307177 | ||
| Window, quartz | Beckman Coulter | 301730 | ||
| Window holder | Beckman Coulter | 305037 | ||
| 12mm double sector Epon centerpiece | Beckman Coulter | 306493 | ||
| Cell plug gaskets | Beckman Coulter | 327022 | ||
| Cell housing plug | Beckman Coulter | 362327 |
Referencias
- Brown, P. H., Balbo, A., Schuck, P. Characterizing protein-protein interactions by sedimentation velocity analytical ultracentrifugation. Curr Protoc Immunol. Chapter 18, Unit 18.15-Unit 18.15 (2008).
- Balbo, A., Brown, P. H., Braswell, E. H., Schuck, P. Measuring protein-protein interactions by equilibrium sedimentation. Curr Protoc Immunol. Chapter 18, Unit 18.8-Unit 18.8 (2007).
- . Home – Workshops [Internet] Available from: https://sedfitsedphat.nibib.nih.gov/workshop/default.aspx
