Aislamiento de células de ratón cavidad peritoneal
Summary
La cavidad peritoneal de los mamíferos contiene diferentes poblaciones de células inmunes crucial para la respuesta inmune innata. Un método eficaz aislamiento es necesario para los análisis bioquímicos y funcionales de estas células. Aquí le ofrecemos un método integral para el aislamiento de las células en la cavidad peritoneal del ratón.
Abstract
La cavidad peritoneal es una cavidad abdominal a la membrana y lleno de líquido de los mamíferos, que contiene el hígado, el bazo, la mayor parte del tracto gastro-intestinal y otras vísceras. Alberga un número de células inmunes como los macrófagos, células B y células T. La presencia de un gran número de macrófagos ingenuo en la cavidad peritoneal lo convierte en un lugar preferido para la recogida de los macrófagos tisulares residentes ingenua (1). La cavidad peritoneal es también importante para el estudio de las células B debido a la presencia de una única cavidad peritoneal residentes subconjunto de células B, conocidas como células B1, además de las células B2 convencionales. Las células B1 están divididas en las células B1a y B1b, que se distingue por la expresión superficial de CD11b y CD5. Las células B1 son una fuente importante de IgM natural que proporciona la protección temprana de una variedad de agentes patógenos (2-4). Estas células son autorreactivos en la naturaleza (5), pero la forma en que se controlan para evitar la autoinmunidad todavía no se entiende completamente. Por el contrario, CD5<sup> +</sup> Células B1a poseen algunas propiedades reguladoras en virtud de su IL-10 capacidad de producción (6). Por lo tanto, las células peritoneales B1 cavidad son una población de células interesante de estudiar debido a su función diversa y muchas preguntas sin resolver relacionados con su desarrollo y regulación. El aislamiento de la cavidad peritoneal células inmunes residentes es difícil debido a la falta de una estructura definida dentro de la cavidad peritoneal. El protocolo se describe un procedimiento para la obtención de células viables inmune a la cavidad peritoneal de los ratones, los cuales pueden ser utilizados para el análisis fenotípico por citometría de flujo y de diferentes ensayos bioquímicos e inmunológicos.
Protocol
Discussion
El aislamiento de células cavidad peritoneal es una técnica importante para el estudio de diferentes células del sistema inmune, los macrófagos y sobre todo específicos subconjuntos de células B. Aunque este es un proceso sencillo, hay algunos pasos críticos implicados. Presencia de contaminación de la sangre en la muestra recogida se debe evitar para obtener una población pura de células peritoneal cavidad. La eutanasia por dislocación cervical debe hacerse con cuidado para evitar la contaminación de la sangre en la cavidad peritoneal. Por otra parte CO 2 puede ser utilizado. Además, durante el procedimiento adecuado cuidado se debe tomar para evitar perforar la vejiga o de otros órganos en la cavidad peritoneal. La recuperación de la mayoría de los fluido que se inyecta es también importante para el rendimiento celular.
Este procedimiento es ampliamente usado para estudiar la biología de los macrófagos ya que un número moderado de residentes, los macrófagos estimulados se puede obtener fácilmente de la cavidad peritoneal, en contraste con la laboriosa tarea de diferenciación de las células mieloides progenitoras en macrófagos maduros in vitro, utilizando el factor estimulante de colonias de macrófagos (8 , 9). El rendimiento de los macrófagos de la cavidad peritoneal puede ser mejorada mediante el método de obtención de tioglicolato, aunque el uso de tioglicolato podría alterar las propiedades fisiológicas de los macrófagos (7).
Las células B son una parte importante de nuestro sistema inmunológico juega un papel crucial en la inmunidad innata y adaptativa. Entre las diferentes subpoblaciones de células B, células B1 constituyen un subconjunto único de las células B participan en la inmunidad innata, la autoinmunidad y la regulación inmune. Las células B1 se ubican principalmente en la cavidad peritoneal y la reposición de uno mismo. Se trata de uno de los principales productores de IgM naturales que proporciona la primera línea de protección contra una serie de virus y bacterias (10-12). Las células B1 son también una fuente importante de IL-10 (6), que es una citocina importante implicado en la regulación inmune. Aunque varios estudios han llevado a cabo con las células B1, todavía hay margen para una mayor evaluación de sus funciones, en contraste, en especial su papel regulador. Celular cavidad peritoneal método de aislamiento ofrece la oportunidad única de estudiar las funciones de las células B1.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado en parte por subvención NIH AI069358 y la Fundación de Investigación BloodCenter.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Thioglycollate Medium, Brewer Modified | BD BBL | 211716 |
Referencias
- Zhang, X., Goncalves, R., Mosser, D. M. The isolation and characterization of murine macrophages. Current Protocols in Immunology. , (2008).
- Boes, M., Prodeus, A. P., Schmidt, T., Carroll, M. C., Chen, J. A critical role of natural immunoglobulin M in immediate defense against systemic bacterial infection. J. Exp. Med. 188, 2381-2386 (1998).
- Mc Daniel, L. S., Benjamin, W. H., Forman, C., Briles, D. E. Blood clearance by anti-phosphocholine antibodies as a mechanism of protection in experimental pneumococcal bacteremia. J. Immunol. 133, 3308-3312 (1984).
- Paciorkowski, N., Porte, P., Shultz, L. D., Rajan, T. V. B1 B lymphocytes play a critical role in host protection against lymphatic filarial parasites. J. Exp. Med. 191, 731-736 (2000).
- Mercolino, T. J., Arnold, L. W., Hawkins, L. A., Haughton, G. Normal mouse peritoneum contains a large population of Ly-1+ (CD5) B cells that recognize phosphatidyl choline: relationship to cells that secrete hemolytic antibody specific for autologous erythrocytes. J. Exp. Med. 168, 687-698 (1988).
- O’Garra, A., Chang, R., Go, N., Hastings, R., Haughton, G., Howard, M. Ly-1 B (B-1) cells are the main source of B cell derived interleukin 10. Eur. J. Immunol. 22, 711-717 (1992).
- Hoover, D. L., Nacy, C. A. Macrophage activation to kill Leishmania tropica: Defective intracellular killing of amastigotes by macrophages elicited with sterile inflammatory agents. J. Immunol. 132, 1487-1491 (1984).
- Austin, P. E., McCulloch, E. A., Till, J. E. Characterization of the factor in L-cell conditioned medium capable of stimulating colony formation by mouse marrow cells in culture. J. Cell Physiol. 77, 121-134 (1971).
- Stanley, E. R. The macrophage colony-stimulating factor, CSF-1. Methods Enzymol. 116, 564-587 (1985).
- Baumgarth, N., Chen, J., Herman, O. C., Jager, G. C., Herzenberg, L. A. The role of B-1 and B-2 cells in immune protection from influenza virus infection. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 252, 163-169 (2000).
- Baumgarth, N., Herman, O. C., Jager, G. C., Brown, L. E., Herzenberg, L. A., Chen, J. B-1 and B-2 cell-derived immunoglobulin M antibodies are nonredundant components of the protective response to influenza virus infection. J. Exp. Med. 192, 271-280 (2000).
- Berland, R., Wortis, H. H. Origins and functions of B-1 cells with notes on the role of CD5. Annu. Rev. Immunol. 20, 253-300 (2002).
